n-3多不饱和脂肪酸抑制骨骼肌蛋白异常分解的研究进展

高颐雄 赵 勤 谭 信* 张 坚*

（1 中国疾病预防控制中心营养与健康所 北京100050 2 北京理工大学生命学院 北京100081）

骨骼肌萎缩主要表现为骨骼肌质量的下降以及骨骼肌力量和功能的减退，它既能增加罹患者跌倒以及跌倒后发生骨折的概率，又能增加慢性非传染性疾病患者的死亡率[1]。既往临床上骨骼肌萎缩常见于慢性非传染性疾病所致的机体代谢紊乱，如肥胖综合征，以及糖尿病、慢性肾脏疾病与癌症恶病质等所致的体重下降[2]。近年来，随我国进入老龄化社会，与年龄增长相关的肌肉衰减综合征（sarcopenia）也日益受到关注[3]。导致骨骼肌萎缩发生的始动因素目前还不清楚，可能与遗传因素、机体代谢状况和慢性非传染性疾病的发生、发展有关。任何导致骨骼肌细胞蛋白分解代谢速率增加并超过合成代谢速率的非正常因素，都可能诱发骨骼肌萎缩。研究骨骼肌细胞蛋白异常分解的诱因及其抑制途径，无论从改善骨骼肌萎缩罹患者的生存质量，还是从降低社会医疗负担的角度考虑，均具有明确而迫切的实际需要。

n-3 多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA）是一类具有多种生理效益的食物成分[4]，其最为熟知的种类是α 亚麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。EPA 和DHA 一般被称为n-3长链多不饱和脂肪酸（n-3 LCPUFA），主要来源于海鱼等动物性食物[5]，ALA 主要来源于菜籽油和豆油等植物性食物[6]。有研究发现：不同n-3 PUFA可以通过多种不同途径刺激胰岛素分泌，增加机体胰岛素敏感性，并降低骨骼肌细胞内有害因素对胰岛素/Akt 信号通路活性的抑制[7]，而胰岛素/Akt 信号通路的正常运作对于抑制骨骼肌细胞蛋白异常分解发挥重要作用[8-9]。由此可见，研究n-3 PUFA 调控骨骼肌组织胰岛素/Akt 信号通路的机制，对于探究骨骼肌萎缩的发生原因与预防措施，具有重要意义。

1 胰岛素/Akt 信号通路抑制骨骼肌细胞蛋白异常分解的机制

在正常情况下，胰岛β 细胞分泌的胰岛素经循环系统到达骨骼肌组织后，与骨骼肌细胞膜上的胰岛素受体α 亚基结合，引起β 亚基的蛋白酪氨酸激酶活化，继而磷酸化胰岛素受体底物-1（IRS-1）的酪氨酸残基。IRS-1 被激活后将信号传导到磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K），再经一系列下游信号传导磷酸化蛋白激酶B（Akt）使之激活[10]。激活的Akt 通过抑制叉头框蛋白O3 转录因子（Fox-O3 transcription factors）的活化，进而抑制由Fox-O3 表达所介导的肌肉特异E3 泛素连接酶Atrogin-1/MAFbx 和自噬介质Binp3 的表达。因为Atrogin-1/MAFbx 表达上调可激活泛素-蛋白酶体系统，促进蛋白分解，Binp3 表达上调可激活自噬溶酶体途径促进自噬作用，所以维持胰岛素/Akt信号通路的活性被认为可以抑制骨骼肌细胞内蛋白的异常分解[8-9]。当胰岛素分泌不足和/或有害因素导致的包括Akt 活性减弱在内的胰岛素抵抗发生时，均可引发一系列骨骼肌细胞内下游信号通路的改变，启动泛素-蛋白酶体系统和自噬溶酶体途径并最终导致骨骼肌细胞蛋白的异常分解[11]。胰岛素分泌不足以及胰岛素利用能力下降常见于糖尿病等机体代谢紊乱。可导致骨骼肌细胞内Akt 活性减弱的有害因素主要包括过量的炎性细胞因子与饱和脂肪酸（SFA）。

炎性细胞因子（如IL-6 与TNF-α）介导的炎症反应和饱和脂肪酸的脂毒性代谢产物对骨骼肌细胞的胰岛素/Akt 信号通路的有害影响往往互为因果，共同导致通路抑制[12]。SFA 的代谢产物，如甘油二酯和神经酰胺等，对骨骼肌细胞的脂毒性作用的主要机理即抑制胰岛素/Akt 信号通路的活性[13]。这些分子可以介导核因子κb（NF-κb）以及多种炎性细胞因子（如TNF-α 和IL-6）的激活与表达，继而通过多种途径导致胰岛素/Akt 信号通路异常，例如：1） 活化的NF-κb 可以通过活化IKK 使IRS-1 的丝氨酸残基磷酸化，从而抑制胰岛素/Akt 信号通路上的重要信号分子PI3K 的活化，并可启动炎性细胞因子（TNF-α 和IL-6）基因的转录；2） 炎性细胞因子的表达上调同样具有进一步活化NF-κb 的作用，并且可以降低骨骼肌细胞IRS-1 的酪氨酸磷酸化和增加其丝氨酸磷酸化，这一磷酸化比例的改变既能导致IRS-1 被泛素化/蛋白酶体降解增加，又能降低IRS-1 与PI3K的p85 亚基结合的能力。炎性细胞因子TNF-α 通过骨骼肌细胞的TNF 受体1 上调蛋白磷酸酶2C的表达，继而降低乙酰辅酶A 羧化酶磷酸化，抑制饱和脂肪酸的氧化分解，增加其在骨骼肌细胞内脂毒性代谢产物的蓄积，形成恶性循环[13-14]。

简而言之，骨骼肌细胞内蛋白的异常分解，特别是泛素-蛋白酶体与自噬溶酶体途径的异常激活，在骨骼肌组织萎缩发生、发展进程中扮演了重要的角色。胰岛素/Akt 信号通路的正常运作有助于抑制上述途径的异常激活。研究并阐明包括膳食在内的多种可以维持胰岛素/Akt 信号通路正常活性的干预手段及其机制，将有助于对抗骨骼肌萎缩的发生及其对罹患者所造成的不良影响。

2 n-3 PUFA 对胰岛素分泌及胰岛素敏感性提高的促进作用

2.1 n-3 PUFA 促进胰岛素分泌的直接/间接途径

以含有ALA（500μmol/L）的培养基培养大鼠源胰岛β 细胞（INS-1），结果显示：48h 后ALA 干预组的基础胰岛素分泌量与葡萄糖刺激的胰岛素分泌量均显著高于棕榈酸（PA）、油酸（OA）和亚油酸（LA）干预组（P＜0.05）。ALA 干预组的G 蛋白偶联受体40（GPR40）的mRNA 表达显著高于对照组（P＜0.01）以及OA 和LA 干预组（P＜0.05），而OA 和LA 干预组则与对照组无显著差异（P＞0.05）。GPR40 蛋白的表达结果与其mRNA 表达结果类似[15]。这一研究提示：ALA 促进胰岛β 细胞分泌胰岛素可能是通过直接活化胰岛β 细胞膜的GPR40达到的。

ALA 间接促进胰岛素分泌的途径同样与GPR40 有关，即：ALA 与肠内分泌细胞胞膜的GPR40 结合后，可促进肠内分泌细胞分泌胰高血糖素样肽-1（GLP-1），进而发挥肠促胰岛素效应[16]。EPA 与DHA 这两种n-3 LCPUFA 则可与肠内分泌细胞胞膜的GPR120 结合，进而刺激GLP-1 的分泌[17]。此外，EPA 与DHA 还可通过下调固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）的表达改善体内脂质代谢环境，从而间接促进胰岛素分泌[18-19]。

2.2 n-3 PUFA 对细胞胰岛素敏感性的影响

ALA 提高胰岛素敏感性的能力主要是通过促进胰岛素样生长因子-1 （IGF-1） 的分泌实现[20]。IGF-1 对骨骼肌细胞膜IGF-1 受体 （IGF-1R）及胰岛素受体均具有亲合性，与这些受体结合后可发挥胰岛素样活性，继而激活下游PI3K、Akt 等信号分子，结果表现为胰岛素敏感性的提高[21-22]。与ALA 相比，EPA 与DHA 间接促进胰岛素敏感性的途径更为丰富，主要包括：1）EPA 与DHA 通过维持Iκb 的活性，从而抑制NF-κb 的活化，继而抑制NF-κb 信号通路的激活和炎性细胞因子（TNFα 和IL-6）的表达，达到提高胰岛素敏感性的目的[23-24]；2）EPA 促进IGF-1 和爱帕琳肽（apelin）的分泌[25-26]，以及DHA 促进IL-10 的分泌[24]，均有助于骨骼肌细胞胰岛素敏感性的增加。

3 n-3 PUFA 维持骨骼肌细胞内Akt 活性抑制蛋白异常分解的研究

Bryner 等[27]以小鼠C2C12 肌管细胞为研究对象，分别用PA（0.5 mmol/L）与DHA（0.1 mmol/L）处理，96h 后PA 处理组的肌管直径与空白对照组相比下降90%（P＜0.001），而DHA 处理组与PA+DHA 处理组96 h 后与空白对照组相比均上升约10%（P＜0.05）。以胰岛素 （100 nmol/L） 处理15 min，Western blot 检测结果显示，PA 处理组磷酸化Akt（p-Akt）的表达仅为空白组、PA+DHA 处理组和DHA 处理组的50%，总Akt 的表达仅为25%～45%（P＜0.02），PA+DHA 处理组和DHA 处理组与空白组相比Akt 表达均无统计学差异[27]。另一项同样以C2C12 肌管细胞为研究对象的类似研究进一步表明，以PA （500 μmol/L） 和/或DHA（100 μmol/L）处理，28h 后棕榈酸处理组的C2C12细胞蛋白降解比空白组上升31%（P＜0.01），而PA+DHA 处理组与空白组相比无统计学差异；实时定量PCR（real-time qPCR）检测结果显示，PA处理组E3 泛素连接酶Atrogin-1/MAFbx 的mRNA（处理4h） 和自噬介质Binp3 的mRNA （处理24h）与空白组相比均显著上升（P＜0.01），PA+DHA处理组与空白组相比无统计学差异；Western blot检测结果显示，从开始处理后2h 起至24h，PA 处理组的Akt473 号位的丝氨酸的磷酸化持续被抑制，而PA+DHA 处理组从处理后4h 起Akt 的磷酸化恢复至空白对照组水平；与空白组相比，DHA干预（24 h）可以显著降低自噬相关蛋白LC3B-II的表达水平（P＜0.05），这一降低与PA 是否存在无关[28]。上述研究表明饱和脂肪酸（PA）及其细胞内代谢产物的脂毒性可以通过抑制胰岛素/Akt 信号通路活性而导致骨骼肌细胞蛋白异常分解，分解的具体途径与泛素-蛋白酶体系统和自噬溶酶体途径的激活有关，而DHA 有助于抑制上述途径的激活并抑制其所造成的有害效应。

ALA（50 μmol/L）同样可抑制C2C12 肌管细胞中PA（500 μmol/L）介导的甘油二酯与神经酰胺的合成，然而该浓度ALA 无法促进骨骼肌细胞中PA 的β 氧化分解，也无法解除PA 对于Akt 活化的抑制效应。EPA（50 μmol/L）和DHA（50 μmol/L）则具有这些能力。这提示：ALA 至少在较低浓度时可能不具有维持骨骼肌细胞Akt 活性的能力[29]。

4 对已有研究的总结与展望

虽然上述研究表明n-3 LCPUFA 具有抑制骨骼肌细胞蛋白异常分解的效果[27-28]，但是以下两个问题的存在仍不容忽视：1）n-3 LCPUFA 主要存在于海鱼类食物中，而增加鱼类食物的消费量与我国大部分居民的传统膳食模式并不相符，民众较难接受。例如，全国营养状况监测数据显示：2012年我国居民鱼虾类食物消费量仅为平均23.7 g/（标准人·d），而且这一数据较2002年的数据平均29.6 g/（标准人·d）还有所下降[30]；2）增加海鱼类食物的消费量同样可能导致消费者特定种类污染物的暴露剂量上升，继而导致其他方面的健康风险增加，如甲基汞所致的胎儿/新生儿神经系统发育损害和二噁英类化合物所致一般人群的癌症罹患风险上升[31-32]。

既往观点认为ALA 等植物来源n-3 PUFA的生理效益主要是通过内源合成途径产生n-3 LCPUFA，以弥补其直接摄入的不足。随着研究的不断深入，植物来源n-3 PUFA 具有独特的生理效益，这一观点正成为共识。如前所述，尽管ALA在骨骼肌细胞内可能不具有维持Akt 活性的能力，但是其具有促进胰岛素分泌与增加胰岛素敏感性的能力，且发挥这些能力的机制与EPA 和DHA 也不尽相同。此外，更加值得重视的一个实际情况是：我国居民植物油的消费量近年来稳步增加，从2002年的32.9 g/（标准人·d）增至2012年的37.3 g/（标准人·d）[30]，而ALA 主要就存在于我国居民消费量较大的部分种类的植物油，比如菜籽油和豆油中[6]。上述研究与调查结果提示，对植物来源n-3 PUFA 生理效益的研究，应该给予像n-3 LCPUFA 一样的关注程度，这不仅与我国居民的膳食模式更加契合，也有助于降低膳食n-3 PUFA 由单一种类食物资源提供而可能导致的食品安全隐患。

ALA、EPA、DHA 在碳链长度与不饱和程度上存在递增关系，它们在维持胰岛素/Akt 信号通路及由此抑制骨骼肌细胞蛋白异常分解的能力上各有侧重，这提示碳链长度与不饱和程度介乎于它们之间的其它n-3 PUFA 可能兼有它们的效能，比如十八碳四烯酸（SDA）。这种n-3 PUFA 在自然界主要发现于紫草科 （Boraginaceae） 蓝蓟属（Echium）植物的种子中，由其提炼的食用蓝蓟籽油中SDA 含量可超过10%。近年来，随着转基因技术逐渐应用于农业，商品化的富含SDA 的转基因大豆油中SDA 的含量可达20%以上[33]。由于上述植物性食物资源的开发，SDA 于近年逐渐受到关注。目前为止，关于SDA 内源转化之外的生理效益的报道仍较为有限，例如有报道指出SDA 干预与CD95 介导的人乳腺癌细胞凋亡间存在关联[34]。然而，SDA 是否能通过胰岛素/Akt 信号通路影响骨骼肌细胞尚未见报道。可以预见，针对包括SDA 在内的n-3 PUFA 的持续研究，将会进一步拓展与深化人们对n-3 PUFA 作用于胰岛素/Akt信号通路，继而抑制骨骼肌细胞蛋白异常分解的认识，并为通过膳食手段预防生理与病理性骨骼肌萎缩提供新的思路。