双shRNA表达载体对HSV-2复制的干扰作用

向红英，兰小松，吕延成

(遵义医学院珠海校区 生物化学教研室，广东 珠海 519040)

Ⅱ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 2，HSV-2)是一种具有包膜的DNA病毒，是造成皮肤、黏膜和神经等外胚层慢性感染和经常性生殖器溃疡的主要病毒之一[1]，利用短发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体转入哺乳动物细胞产生小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)可以干扰HSV-2基因的表达[2-5]。本研究利用带有多个启动子的表达质粒，针对HSV-2的UL27和UL54构建了一种可同时表达双短发卡RNA(Duo-shRNA)的重组载体，通过与单-shRNA重组表达载体进行比较，探讨其对HSV-2病毒复制的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 HSV-2333病毒株标准品购于广州博特生物技术公司，人胚肾293细胞株(HEK293)和E.coliDH5α由本校区生物化学与分子生物学实验室提供，带有多个启动子的pGenesil10-3p质粒(见图1)及用于表达shRNA的寡核苷酸链由武汉市淅玛生物技术有限公司提供并进行连接构建。 限制性内切酶BbsI、BamH I和PstI、TRIzol试剂购自日本Takara公司，SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自日本Toyobo公司，新生牛血清购自中国杭州四季青公司，质粒小量提取试剂盒购自中国杭州爱思进生物技术有限公司，HSV-2 gB和ICP27抗体分别购于美国Santa Cruz Biotechnology公司和Abcam公司，Lipofectamine2000转染试剂盒和DMEM分别购自美国Invitrogen公司和Gibco公司。

主要仪器有产自中国苏州净化设备厂的YJ-1450型医用净化工作台，德国徕卡公司的Elx-800型全自动酶标仪，德国eppendorf公司的5810R台式冷冻离心机及美国SHEL公司的CO2培养箱等。

图1 pGenesil10-3p质粒结构

1.2 方法

1.2.1 HSV-2UL27、UL54干扰靶位点的选择和shRNA表达载体的构建 从GenBank上检索HSV-2(NC_001798)UL27和UL54编码序列，参照shRNA设计原则，对其保守区域序列进行筛选，合成干扰靶序列，采用pGenesil10-3p质粒分别构建表达单、双shRNA的表达载体。另构建两条不干扰任何基因的随机序列作为阴性对照组(Negative control,NC)。选择的干扰基因靶序列及构建的质粒表达载体(见表1)。

表1反义靶点的DNA模板序列

序列名称序列 靶点UL27-shRNAGAACCATGTTGGTGACCTTGG75-95UL54-shRNAGCGTGGTGCAAGATGTGCATT1081-1101Duo-shRNAGAACCATGTTGGTGACCTTGGGCGTGGTGCAAGATGTGCATTNC-shRNAGTATGACAACAGCCTCAAGTGTATGACAACAGCCTCAAGGRandom sequence

1.2.2 HEK293细胞的转染 HEK293在37 ℃，5% CO2条件下，在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养液中按常规方法进行培养(下同)。取对数生长期的细胞接种于24孔培养板中(每孔约4×104～5×104个细胞)。实验分为NC-shRNA(阴性对照组)、空载体(空白对照组)和干扰组；干扰组包括：单干扰组(UL27-shRNA和UL54-shRNA组)、单干扰联合组(UL27-shRNA+UL54-shRNA)和Duo-shRNA组，每组设3个复孔。培养24 h至细胞生长至一定丰度后，分别取上述构建的单、双shRNA表达质粒配制质粒转染混合物(质粒与Lipofectamin2000比为0.8 μg：2 μL)，每孔细胞中加入100 μL质粒转染混合物后再培养48 h，荧光显微镜观察转染情况。

1.2.3 HEK293细胞接种病毒 HSV-2在HEK293中进行扩增培养，收集病毒并用终点滴定法检测病毒滴度，HSV-2的滴度用半数组织培养感染剂量(TCID50)表示。1.2.2中的转染质粒的细胞培养48 h后，去掉细胞上清后加入TCID50为10-5.25/0.1 mL的病毒悬液100 μL/孔，继续培养1～2 h后去掉病毒液，后加入2% DMEM进行培养，48 h后收集细胞上清液进行病毒滴度检测，收集细胞提取总RNA和总蛋白进行mRNA和靶蛋白分析。

1.2.4 子代病毒滴度的测定和细胞存活率检测 收集各孔细胞培养上清液，同上用终点滴定法测定上清病毒滴度并计算各组TCID50，剩余的细胞用MTT法测定细胞存活率，以检验表达的siRNA对HSV-2复制的抑制效果。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测靶基因mRNA的表达水平 抽提细胞总RNA，用DNase Ⅰ去除非特异性DNA片段并检测RNA纯度和完整性，采用随机引物法进行反转录，实时荧光定量PCR仪进行PCR 扩增。UL27上游引物：5'-CAAAGACGTGACCGTGTCGCAG-3'，下游引物：5'-GCGGTGGTCTCCATGTTGTTCC-3'；UL54上游引物：5'-CCAGGACCCTATCATCGGAACG-3'，下游引物：5'-AGTATTTCAATGAGACCCGCCAT-3'；内参GAPDH上游引物：5'- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。引物由上海生物工程公司合成，PCR参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 32 s，共42个循环。以GAPDH为内参标准，△△比较法计算各组UL27和UL54 mRNA的相对表达量并计算对靶基因表达的抑制率。

相对mRNA表达量 =(Ct靶基因- Ct内参)干扰组-(Ct靶基因- Ct内参)对照组。

mRNA抑制率(%)=(1-干扰组相对mRNA表达量/对照组相对mRNA表达量)×100%。

1.2.6 蛋白质印迹法检测gB和ICP27蛋白表达 提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量分析。12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，电转移法将电泳蛋白条转至PVDF 膜，加入一抗4 ℃孵育12 h，漂洗后加入二抗，37 ℃作用40 min。用ECL试剂盒对WB条带进行化学荧光显色，X线胶片经ImageJ图像分析软件对蛋白条带进行定量分析。gB和ICP27蛋白表达量以管家基因表达的蛋白(GAPDH)为参照计算。并按如下公式计算：相对表达量(%)= 目的条带灰度值/内参条带灰度值×100%。

2 结果

2.1 细胞上清液中病毒滴度 接种病毒48 h后检测细胞培养上清病毒滴度(见表2)。其中NC-shRNA与空白对照组无差异(P>0.05)，单、双-shRNA表达载体与空白对照相比均能使细胞上清液中的病毒滴度降低(P<0.05)，且单干扰联合组(UL27-shRNA +UL54-shRNA)和Duo-shRNA组比单干扰组降低病毒滴度的效果更好(P<0.05)，表明对于双基因的干扰能够更有效的抑制HSV-2的复制，但单干扰联合组与双干扰组之间对于病毒滴度的影响无显著性差异(P>0.05)。

表2接种48 h后各试验组HSV-2病毒滴度

组别HSV-2 病毒滴度/100 μL空白对照10-6.2±0.3NC-shRNA10-6.3±0.3UL27-shRNA10-3.2±0.3 ∗UL54-shRNA10-3.4±0.1 ∗UL27-shRNA +UL54-shRNA10-2.0±0.2 ∗△#Duo-shRNA10-2.2±0.3 ∗△#※

*:P<0.05,与空白对照组相比; △：P<0.05,与UL27-shRNA相比; #：P<0.05,与UL54-shRNA相比; ※：P>0.05,与UL27-shRNA+UL54-shRNA相比。

2.2 细胞存活率 通过MTT法检测各实验组细胞存活率(见图2)。NC-shRNA组与空白对照相比无显著差异(P>0.05)，单、双-shRNA干扰组与NC-shRNA组相比均有显著差异(P<0.05)，且干扰联合组和Duo-shRNA组的细胞存活率明显高于单干扰组(P<0.05)，但干扰联合组与Duo-shRNA组比较无显著差异(P>0.05)。表明采用shRNA干扰技术能够提高细胞的存活率，而且对于双基因的同时干扰会更有效。

*：P<0.05,与阴性对照组相比; #：P<0.05,与Duo-shRNA相比; △：P<0.05,与UL27-shRNA,UL54-shRNA相比; ※：P>0.05,与UL27-shRNA+UL54-shRNA。图2 MTT法测定HEK293细胞存活率

2.3 靶基因 mRNA的抑制效率 从接种HSV-2病毒48 h后计算得出各实验组靶基因mRNA表达抑制率(见表3)。单、双-shRNA干扰组与空白对照相比均具有显著性差异(P<0.05)，表明单、双-shRNA表达载体均能在一定程度上干扰其靶mRNA的表达；且单干扰组对UL27mRNA和UL54 mRNA抑制率明显低于干扰联合组和Duo-shRNA组(P<0.05)，表明对多个靶基因的干扰能够在mRNA水平上降低每一个基因的表达量；而干扰联合组与Duo-shRNA组之间对UL27、UL54 mRNA抑制率无显著差异(P>0.05)。

表3各试验组UL27、UL54 mRNA抑制率

组别UL27mRNA抑制率(%)UL54mRNA抑制率(%)Blank control——NC-shRNA33UL27-shRNA65∗—UL54-shRNA—72∗UL27-shRNA+UL54-shRNA85∗△81∗#Duo-shRNA84∗△※88∗#※

*：P<0.05,与空白对照组相比；△：P<0.05,与UL27-shRNA相比; #：P<0.05,与UL54-shRNA相比; ※：P>0.05,与UL27-shRNA+UL54-shRNA相比。

2.4 靶基因蛋白表达水平 采用Western blot检测UL27编码的gB蛋白和UL54编码的ICP27蛋白表达水平(见图3～4)。从实验结果可以看出，

*：P<0.05,与阴性对照组相比；△：P<0.05,与UL27-shRNA相比; #：P<0.05,与UL54-shRNA相比。图3 Western-blot检测gB蛋白表达水平

*：P<0.05,与阴性对照组相比；△：P<0.05,与UL27-shRNA相比; #：P<0.05,与UL54-shRNA相比。图4 Western-blot检测 ICP27蛋白表达水平

各shRNA干扰组与NC-shRNA组相比gB和ICP27蛋白的表达都明显降低(P<0.05)，表明无论是对两个靶基因还是对其中的任何靶一个基因干扰，都会影响到靶蛋白的表达；干扰联合组和Duo-shRNA组与单基因干扰组相比，降低靶蛋白的效果更为明显(P<0.05)，表明双基因的干扰优于单基因的干扰，但干扰联合组和Duo-shRNA组之间无显著差异(P>0.05)。数值用靶蛋白GAPDH条带的灰度值表示。

3 讨论

实验利用带有多个不同启动子的框架，在hU6启动子后连接针对UL27的shRNA表达序列，同时在hH1启动子后连接针对UL54的shRNA表达序列，构成反式表达双shRNA的表达载体质粒，构建经脂质体转染HEK293细胞后再感染病毒，通过对细胞存活率、子代病毒滴度、靶基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平检测结果表明，这种串联反式双shRNA的表达载体，在抑制HSV-2复制、干扰靶基因的表达，提高对宿主HEK293细胞保护作用方面都明显优于单-shRNA表达载体，并可以达到利用两个单-shRNA表达载体相同的干扰效果。虽然利用化学合成的siRNA导入细胞或载体介导shRNA的方式产生RNAi[6-7]取得不错的效果，但对病毒成功实施RNAi的关键是如何使细胞内的siRNA具有长期持久的作用以及对病毒基因发挥有效的干扰作用，然而化学合成的siRNA 所致的基因沉默具有暂时性的特点，使其在抑制病毒复制应用上受到一定限制。而使用shRNA序列的表达载体就能克服这一缺点，shRNA转人细胞后在Dicer酶作用下转化成siRNA，此方法持续时间长，但通过产生单个shRNA的方式对病毒的单个基因实施干扰，很难完全抑制病毒的复制[3]。因此提高siRNA对病毒基因的干扰效率，可能的途径之一是对病毒多个靶基因同时实施干扰，针对病毒不同的靶基因构建多个shRNA表达载体，然后同时转染细胞，表达产生不同的siRNA。这种由多个shRNA表达载体实施的联合干扰作用可以有效抑制病毒的增值[8]，但该过程需要构建不同的shRNA重组表达载体，并经过多步转染，操作繁琐，而且质粒上携带的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)具有的“毒性效应”可导致细胞死亡率增加[9-10]。

因此实施多靶位点RNAi具有一定的优势[11]，利用多启动子的表达载体对病毒进行多靶点的基因干扰能够达到多基因干扰的目的，不仅能够提高干扰效率，有效抑制病毒复制，保护宿主细胞，同时具有操作简便易行的特点。虽然现在对这种多基因干扰中病毒基因之间的相互作用和影响的机制还不完全清楚，但它可能成为抑制病毒复制的一种有效方法。

综上所述，本文利用双启动子的方法构建了针对HSV-2的UL27和UL54的shRNA质粒表达载体。并比较了双shRNA表达载体和UL27-shRNA+UL54-shRNA联合介导的双基因干扰、UL27-shRNA和UL54-shRNA介导的单基因干扰对抑制HSV-2病毒靶基因mRNA表达水平以及病毒在HEK293细胞中增殖。结果表明双shRNA对HSV-2病毒的抑制效率较单基因干扰好，同时解决了双载体双基因介导基因沉默在转染细胞后可能出现的载体数量上的差异和均一性问题。