中医证候上火与生物标志物之间的相关性

周严严 赵海誉 王宏洁 司南 王彦礼 杨健 边宝林

中国中医科学院中药研究所 北京 100700

上火是临床上常见的一种病症，包括口腔溃疡、牙龈肿痛、口燥咽干、鼻衄、目赤，并可伴有小便短赤、大便干结等症[1-2]。上火的原因与食物、劳累、环境等密切相关[3-6]。现代医学认为“上火”发病机制为中分子物质过多、下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统功能偏低、肠道微生态失衡导致肠道处炎症状态[7-10]。“上火”与菌群失调具有相关性，菌群结构及功能失调，可诱导氧化应激，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性下降，促炎因子分泌增多，同时导致脂质代谢紊乱，从而引发局部炎症反应的发生[11]。从“上火”到形成疾病是一种包括中枢、内分泌及免疫系统的应激负荷反应过程[11-12]，可见“上火“与炎症因子、氧化应激、能量代谢和脂质代谢密切相关，同时也与中枢神经系统和菌群有关。

1 “上火”促进炎症因子的释放与合成

从病症表现上，上火与发炎有着一样的症状，均表现为红、肿、热、痛的现象，如牙龈疼痛、咽喉干痛、口舌生疮、口渴口苦、大便干结等症状。“上火”患者的一些临床表现是由于抗炎与抑炎的平衡被破坏[13]。炎症发生时，致炎因子对自身组织攻击导致体内免疫系统紊乱，导致生理机能失调而致机体病变。有研究者认为防治上火应保障机体平衡，提高免疫力，而炎症的发生也与免疫力有着密切关系[13-14]。“上火”属于中医“热证”范畴，实热证以免疫亢进为主，虚热证以免疫功能降低为主，两者都存在T细胞免疫功能紊乱。其中Th3主要在黏膜组织中诱导生成，并通过分泌转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和少量的白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）促进分泌性免疫球蛋白 A（secretory immunoglobulin A,sIgA）分泌，增强黏膜免疫力[11]。牙龈炎的发生和菌斑内的细菌积聚有密切关系，尤其是革兰阴性厌氧菌的内毒素刺激单核细胞、成纤维细胞等分泌肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis Factor-α,TNF-α）、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）等多种炎症介质。而内毒素在体内通过对细胞的直接毒害作用、介导炎症反应和免疫应答三种途径，来对牙周组织造成一定的破坏[15-19]。其中IL-1β起关键作用，牙龈组织中IL-1β的含量与炎性细胞浸润的程度和牙龈炎的临床严重程度呈正相关[20-23]。说明上火与 IL-1β、TGF-β、IL-4、IL-10、TNF-α、IL-6、MCP-1等炎症因子的释放与合成有关。

汪琴静等[24]通过对“上火”人群中细胞因子激活素A（activin,A）及E选择素（E-selectin）血清含量的测定以及外周血单个核细胞基因表达水平检测，发现“上火”患者血清中以及外周血单个核细胞activin A、E-selectin基因表达水平均高于正常人群，说明“上火”是一种局部的炎症反应，诱导炎性反应影响机体生理平衡，这是“上火”机制之一。另外，采用i－TRAQ-2DLCMS/MS蛋白组学技术与生物信息学手段分析，知柏地黄丸可通过调节大鼠血清凝溶胶蛋白(gelsolin,Gsn)、纤溶酶原(plasminogen,Plg)、纤维蛋白原 α 链（Fibrinogen α chain,Fga）、胸腺素 β4（thymosin β4,Tmsβ4）和胶原蛋白 α2-I型链（collagenα2-I chain,Col1a2）的水平清除损伤组织，抑制细胞凋亡作用。同时可降低促炎炎症因子的分泌，促进炎性反应损伤愈合的作用[25]。

2 “上火”引起氧化应激反应

情志刺激、辛辣食物、劳累过度等因素导致机体内环境变化，过量的氧自由基诱导氧化应激反应，脂质过氧化产物明显增多，其中4-羟基壬烯酸（4-hydroxynonenal,4-HNE）通过显著抑制细胞AMPK磷酸化水平，诱导细胞损伤。运用中药系统药理学来分析黄连解毒汤，进而研究“上火”与氧化应激之间的关系，结果表明“上火”与氧化应激或者自由基增多密切相关[26]。观察临床实热“上火”组血浆中丙二醛（malonaldehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）浓度水平均高于对照组，而白细胞内的活性氧（reactive oxtgen species,ROS）含量显著下降，提示实热“上火”与氧化应激关系密切[27]。

“上火”状态会激活细胞内的NO合酶基因的表达产生大量NO，NO在超氧阴离子的作用下大量转化成毒性更强的过氧硝酸根离子，其破坏呼吸链复合酶导致ROS大量的产生。同时使ROS消除通路中的关键酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)活性异常，大量 ROS转化成毒性很强的羟自由基，羟自由基造成DNA断裂、蛋白质变性及脂质过氧化。最终使得细胞MDA含量升高，氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity,ORAC）下降，使机体功能下降(图1)[25]，表明维持体内的自由基和抗氧化防御系统的平衡可有效缓解“上火”的症状。另外，有研究通过蛋白质组学筛选实热“上火”血清差异表达蛋白，载脂蛋白C3(apolipoprotein C3,ApoC3)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和维生素K依赖蛋白S(vitamin K-dependent protein S,PROS1)等显著上调，而载脂蛋白A4(apo-lipoprotein A4,Apo A4)、超氧化物歧化酶3(superoxide dismutase 3,SOD3)和纤溶酶原激活物抑制剂1(plasmino－gen activator inhibitor 1,PAI-1)等显著下调，其中细胞外SOD3具有抗血管生成和抗炎作用。当组织细胞受到炎性反应等损伤时，LDH会释放到细胞外，血中含量相应增加。结合代谢组学结果乳酸含量在“上火”人群中升高，表明实热“上火”情况下糖酵解增强[28]。张方博等[29]研究表明上火牙龈炎时，大鼠饮水量和尿量减少，总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)和过氧化氢酶 (hydrogen peroxidase catalase,CAT)表达水平降低。黄连解毒汤作为清热解毒的经典代表方，祛除“上火”的复方，能增加大鼠饮水量和尿量，升高 T-SOD和CAT的表达水平。说明黄连解毒汤可通过抑制氧化应激缓解上火牙龈炎症状。综上表明改善氧化应激因子可缓解上火症状，如 ROS、4-HNE、LDH、GPX、SOD3、MDA 等。

3 “上火”引起能量和脂代谢失常

上火作为一种火热病症，其与寒证的最直观的区别主要在于能量代谢的高低。AMPK是调节能量代谢的关键因子，而能量代谢又与炎症密切相关[30]，由于生理过程需要能量去维持脑、中枢神经系统、心脏及肌肉等的组织功能，而机体的能量来源主要通过饮食中的葡萄糖和脂质提供，应激会直接影响体内的糖代谢及脂代谢过程，因而体内糖代谢及脂代谢低下也被认为是“上火”引起身心疲劳的一个原因。

图1 应激负荷造成机体氧化损伤的机制示意图Fig.1 Schematic diagram of mechanism of oxidative damage caused by stress load

能量代谢紊乱可引起黏膜损伤，使黏膜免疫系统中 Th17/Treg细胞比例上调，sIgA分泌减少，局部黏膜免疫力下降，可能进一步感染进而引起黏膜损伤。因此，头面部黏膜上皮组织的生理特点决定了其是上火的易发部位。与健康对照组相比，患有重度牙龈炎的患者体内短链羧酸的含量大于10倍。若用短链羧酸刺激健康人群，能够促进牙龈炎症反应的发生，同时也能促进促炎因子的释放与合成。而短链羧酸又能激活AMPK，说明牙龈炎与AMPK和炎症有密切关系[31-32]。

丙酮酸是糖酵解过程中的产物，正常情况下通过三羧循环氧化成CO2和H2O。血中乳酸/丙酮酸的比值正常维持在9左右。当机体缺氧时，丙酮酸被还原为乳酸，该比值上升。有研究采用GC-MS技术对实热上火后血清代谢物的特异性变化进行分析，与正常对照组比较，实热上火人群血清中乳酸、油酸、亚油酸、甘油、酪氨酸和三羧酸循环中间物（柠檬酸、琥珀酸、苹果酸）等表达显著上调，而丝氨酸、苏氨酸、4-羟基脯氨酸等显著下调，表明实热上火人群体内能量代谢处于旺盛的状态且局部有炎性反应，如溃疡、咽炎、牙龈炎等[33]。炎性反应部位物质分解代谢加快，组织耗氧量增加，引起无氧糖酵解增强，释放的乳酸未能及时被清除，发生堆积，导致患者血中乳酸出现上调[27]。这些研究说明实热上火人群中能量代谢相关的变化主要集中在糖酵解、三羧酸循环、脂质代谢三个方面（图 2）。

上火牙龈炎时果糖二磷酸醛缩酶C、磷酸甘油醛异构酶1和结节性硬化综合征2型(Tuberous sclerosis complex-2,TSC2)均表达升高，黄连解毒汤可通过降低果糖二磷酸醛缩酶C和磷酸甘油醛异构酶1的表达，抑制能量代谢相关通路分子TSC2的表达，发挥治疗上火牙龈炎的作用[29]。

4 “上火”会引起神经-内分泌功能紊乱

从“上火”到形成疾病是一种包括中枢、内分泌及免疫系统的应激负荷反应过程，应激负荷涉及到中枢皮层及边缘系统和下丘脑一垂体一肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)的神经递质、激素、基因表达等多层次，可以部分反应心理的应激状态[34]。HPA与中医理论中的“肾-天癸-冲任-胞宫”具有相似功能。虚热证时，垂体-甲状腺机能活跃，去甲肾上腺素（noradrenaline,NE）、肾上腺素（epinephrine,E）、儿茶酚胺（catecholamines,CA）等含量增高，红细胞上乙酰胆碱酯酶活性增高，实热证早期，交感神经和垂体-肾上腺系统机能增强，皮质素增多，5-羟色胺(serotonin,5-HT)降低，结果说明无论虚热证还是实热证均能引起神经-内分泌功能紊乱[35]。何蓉蓉[36]研究发现广东凉茶在抗应激作用时，应激负荷大鼠模型的大脑皮质、海马和血浆中5-HT和5-吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)含量显著低于正常对照组，说明凉茶对“上火”模型大鼠中枢神经递质具有一定的调节作用。

图2 糖酵解、三羧酸循环、脂质代谢相互关系示意图Fig.2 Schematic diagram of the relationship between glycolysis,tricarboxylic acid cycle and lipid metabolism

5 “上火”的发生同菌群改变密切相关

“上火”者表现有能量代谢紊乱及粘膜免疫失调。菌群多方面参与机体的能量产生、转化、储存和利用，并通过改变组织对能量的利用方式、改变 AMPK磷酸化等途径来影响机体的能量代谢，因而菌群微生态失衡可导致能量代谢发生失调。肠粘膜免疫功能下降会使肠道处于炎症状态，造成肠道微生态平衡紊乱[14]。与肠道菌群类似，口腔中细胞炎症因子(如金属蛋白酶、一氧化氮合成酶、前列腺素E2、干扰素－γ)与牙周软硬组织炎症程度呈正相关关系，当患者食用益生菌如含乳酸杆菌的食物后，体内细胞炎症因子水平显著降低。因此口腔菌群微生态与炎症密切相关[37-38]。口腔微生态研究已经成为研究热点，有研究表明牙周炎患者的唾液中也发现生物标志物，其中血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide,VIP）和神经肽 Y（neuropeptide Y,NPY）在唾液中的水平高于血清水平，因此唾液中VIP和NPY可能是牙龈炎或牙周炎唾液中的潜在差异生物标志物[37]。与正常牙龈组织相比，牙龈炎组织的纤溶酶原激活剂活性显著提高，龈沟液和未刺激唾液中的溶菌酶活性与牙龈炎或牙周炎患者的牙周袋深度相关。牙周炎组龈下菌斑样本中的消化链球菌、牙结核杆菌和直肠弯曲菌占优势。而牙龈炎中缠结优杆菌和侵蚀艾肯菌占优势[39-41]。

除此之外，王召平[42]对体检人群中的261例上火者及121例非上火者的体检数据进行统计分析，显示上火组的体重指数（body mass index,BMI）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、血尿酸（blood uric acid,BUA）高于对照组，高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、尿比重（specific gravity of urine,SG）显著低于对照组，说明体内的代谢废物蓄积可能是“上火”的物质基础之一，肾脏的排泄功能对清除“上火”具有重要意义，并推测尿样中可能存在与上火有关的生物标志物，需要进一步的探讨研究。

6 结语

综上所述，上火是在精神紧张、过度劳累、饮食刺激、口腔或肠道微生物感染等因素综合作用下，人体内环境发生以炎症免疫、氧化应激、能量代谢和脂质代谢为主的变化，同时伴有中枢神经系统中神经递质变化和菌群的失调，主要表现为头面部皮肤黏膜发生红肿热痛等炎症反应。可见上火是以“炎症因子-氧化应激因子-能量相关因子”为主要指标，并且这些指标受中枢神经和菌群的影响。当然，这些指标需通过临床试验进一步验证，为下一步找到临床可检测的生物标志物奠定基础。