片仔癀治疗溃疡性结肠炎的实验研究

邱 赟 ，韩升霞 ，刘丽雅 ，沈阿灵 ，林于雄

（1.宁德市中医院，福建 宁德 352100；2.福建中医药大学，福建 福州 350122）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）属常见肠道疾病，主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）、克罗恩病（crohn's disease，CD），其中以UC较为多见。 UC是一种反复发作、病因尚不明确的慢性非特异性肠道疾病，临床主要表现为腹痛、腹泻以及粘液血便。近年来，炎症性肠病的发病率成上升趋势，已成为我国常见的消化道疾病之一［1-2］。新近研究发现：钙卫蛋白（calprotectin，CP）和干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-6（IL-6）等炎性因子相似，是中性粒细胞来源的炎性反应蛋白，也因此被当作一种新型的炎症标记物，已成为国内外学者关注的热点，在检测炎症性肠病的进程中具有重要作用［3-4］。

闽产特色中成药片仔癀（pien tze huang，PZH）至今已有450多年的历史，是由漳州片仔癀药业股份有限公司独家生产的国家一级中药保护品种，在国内外享有较高知名度的中成药品种之一。在长期的临床应用中，片仔癀对包括急慢性肝炎在内的许多炎症相关性疾病都具有明确的治疗作用［5］。为了进一步探讨片仔癀对UC的治疗作用及其机制，本研究通过建立葡萄糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的UC小鼠模型，观察片仔癀对UC小鼠钙卫蛋白和细胞炎症因子的影响，以期为片仔癀的二次开发提供进一步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂 片仔癀（漳州片仔癀药业股份有限公司，生产批号：2016020001），规格 3 g／粒，配制前用刮刀刮取适量片仔癀，用双蒸水溶解配制成0.1 g／mL，于 4 ℃保存待用；葡萄糖硫酸钠（DSS，美国 MP Biomedicals公司）；CP、IFN-γ 和 IL-6 ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；Bradford蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.2 实验动物 雄性SPF级BALB／c小鼠24只，体重为18～20 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，福建中医药大学实验动物中心适应性喂养1周后进行实验研究。

1.3 仪器 ELX800酶标仪（美国Bio-Tek公司）；AB204-N电子天平（瑞士Mettler toledo公司）；5417R高速冷冻离心机（德国 Eppendorf公司）。

1.4 分组及给药 采用饮用含有3%DSS饮用水的方法诱导建立UC小鼠模型。将24只BABL／c小鼠按随机数字表法分为正常组、模型组和治疗组各8只。正常组给与正常饮用水，模型组和治疗组连续自由饮用含 3%DSS的饮用水 7 d［6-7］，从第 8天开始模型组和治疗组恢复给予正常饮用水，至第11天实验结束。在造模前1天，治疗组开始口服灌胃PZH 溶液（剂量为 234 mg／kg），每日给药，正常组和模型组口服灌胃与PZH溶液等体积的生理盐水。

1.5 疾病活动指数（disease activity index，DAI）

实验结束后，参考文献［8］，采用盲法方式观察并记录小鼠体重、腹泻和便血等临床体征，按表1进行评分［7-9］，表中3项指标得分平均值即为DAI。

表1 DAI计算方法

1.6 血样标本和结肠组织标本的采集 在第11天实验结束后，小鼠眼框采集血样标本，然后用颈椎脱臼法处死小鼠后，在冰上操作，由肛门向上截取结肠标本，生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，测量结肠长度并记录；同时留取结肠样本用于病理组织学检测。

1.7 病理组织学检测 取约1.0 cm结肠组织，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm厚组织切片，苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察结肠组织病理学变化。

1.8 IFN-γ、IL-6和CP的检测 采用酶联免疫分析（ELISA）检测小鼠血清中 IFN-γ、IL-6和 CP水平，详细操作步骤参照试剂盒说明。

1.9 统计学方法 本实验采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料属正态分布的以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组小鼠体重、DAI和结肠长度的比较 由表2可见：经3%DSS可建立UC小鼠模型，片仔癀干预能够显著改善DSS诱导的UC。

2.2 各组小鼠结肠组织形态学的变化 由图1可见：正常组小鼠结肠黏膜完整，黏膜上皮细胞排列整齐，腺体排列整齐、结构清楚，有大量的杯状细胞，未见显著病理形态学改变；而模型组结肠组织黏膜结构不完整，可见结肠黏膜脱落形成的溃疡灶，大量炎症细胞浸润黏膜及黏膜下层，以中性粒细胞为主，并伴有少量淋巴、单核细胞，腺体正常结构丧失，排列紊乱，腺腔消失；治疗组中小鼠结肠坏死灶、溃疡面积较模型组有所减少，黏膜和腺体排列与模型组比较较整齐，炎性细胞浸润黏膜层及黏膜下层明显减少。可见，片仔癀能明显缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症病变程度。

表2 各组小鼠体重、DAI和结肠长度的比较

图1 各组小鼠结肠的 HE染色结果（×100）

2.3 各组小鼠血清中IFN-γ、IL-6和CP水平变化比较 由表3可见：片仔癀可能通过抑制血清中IFN-γ、IL-6和CP的水平，起到缓解DSS诱导的结肠炎作用。

表3 各组小鼠血清中IFN-γ、IL-6和CP水平变化比较

3 讨 论

现代医学认为UC的发生发展与遗传性、免疫调节异常、感染和环境等因素有关，但对其发病机制尚不完全明了。UC由于其病程长、易复发和缓解期与活动期反复交替，因此世界卫生组织定义其为现代难治疾病之一［10］。目前临床常用治疗药物有糖皮质激素制剂、5-氨基水杨酸制剂、生物制剂等［11］。但激素类药物具有降低抗感染的免疫力，可诱发上消化道出血、骨质疏松等不良反应；而5-氨基水杨酸类药物易引起腹泻、恶心、皮疹等毒副作用。因此，寻找更为安全且疗效好的治疗药物显得尤为重要。而长期的临床实践证明，传统的中药复方对本病治疗有积极作用，其标本兼治、多途径和毒副作用少等优点，已经呈现出了巨大的开发价值和潜力 ［12-14］。

片仔癀处方和工艺属于国家绝密级组方，目前公开的处方为三七、牛黄、麝香、蛇胆等4味药材，具有显著的清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛功效。本研究结果表明：片仔癀对DSS诱导的UC模型小鼠具有良好疗效，经片仔癀治疗后可抑制DSS诱导的体重下降、DAI评分增加和结肠缩短，以及减少模型小鼠结肠的溃疡灶和炎性细胞浸润。

IFN-γ和IL-6是Th1型细胞因子的重要组成部分，二者均是促炎症细胞因子，在炎症反应过程中起着重要的作用。近年来的许多研究已经证实，IFN-γ和IL-6及其信号传导通路参与了UC的发生发展［15-17］。临床研究表明：UC患者血清中IFN-γ和IL-6的含量会显著增加［18-19］。CP是一种来源于中性粒细胞和巨噬细胞的含钙蛋白，其表达具有组织或细胞特异性，是嗜中性粒细胞的主要炎性反应蛋白。中性粒细胞的脱颗粒可释放CP，是中性粒细胞更新的重要标志物［20-21］。近年来的研究发现：CP作为一种新型急性炎症标志物，在UC患者中明显升高［3，22］。本研究结果显示：IFN-γ、IL-6 和 CP 在UC模型组小鼠血清中的含量与正常组比较明显升高，片仔癀可以有效地抑制IFN-γ、IL-6和CP含量的增加，说明抑制IFN-γ、IL-6和CP含量的增加可能是片仔癀治疗UC的作用机制之一。

综上所述，UC发生发展是多因素、多环节作用的结果，而片仔癀治疗具有多成分、多途径的作用机制特点。在本实验研究的基础上，我们将继续深入开展片仔癀治疗UC作用机制研究，以期阐明片仔癀治疗UC的作用机理、靶点和通路，为扩大片仔癀的临床适应症和为其二次开发提供进一步的实验依据。