牛角地黄汤对金黄色葡萄球菌耐药性的影响及转录组学分析

2019-01-17张亚飞栗云鹏杨佐君孙英健

四川农业大学学报 2018年6期

冯烁，张亚飞，栗云鹏，杨佐君，孙英健

（北京农学院动物科学技术学院，北京 102206）

牛角地黄汤源于唐代《千金备急药方》，是由犀角、地黄、丹皮、赤芍四种主要成分组成[1]，目前原方中的犀角由牛角替代。牛角地黄汤在临床上被公认为是治疗温病血分证候的代表方剂，具有凉血散瘀、清热解毒的功效[2]，现代中医常将本方用于治疗急性重症肝炎、肝昏迷、尿毒症、过敏性紫癜、败血症等血分热盛型疾病。金黄色葡萄球菌（简称金葡菌，Staphylococcus aureus），有“嗜肉菌”的别称，致病力强，能产生的多种毒素和酶类，如溶血素（hemolysin）[3]、肠毒素（enterotoxin）[4]、毒性休克综合征毒素-1（TSST-1）[5]、凝固酶（coagulase）[6]等是细菌产生的重要的毒力因子。动物感染金葡菌可引起机体局部化脓性感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎，甚至败血症、脓毒血症等严重的全身感染[7]。特别是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）几乎遍及全球，感染率和死亡率都较高[8]，多药物耐药的MRSA出现，增加了控制细菌感染的难度[9-10]。现有研究发现部分中药具有降低细菌耐药性的作用[11-13]。本课题组的前期研究发现，牛角地黄汤具有抑制金葡菌毒力因子溶血素活性及溶血素、肠毒素等毒力因子分泌的作用[14]。但牛角地黄汤对金葡菌耐药性的影响尚未见报道。因此，本研究旨在研究牛角地黄汤对金葡菌对金葡菌苯唑西林钠耐药性及相关基因表达水平的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

金葡菌ATCC-29213和ATCC-43330购自鼎国生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

水牛角、生地黄、赤芍、丹皮购自北京同仁堂药店；MHB培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；苯唑西林钠购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 金葡菌对苯唑西林钠的耐受性检测

以不含药物的细菌培养组为阴性对照组，给予两种金黄色葡萄球菌ATCC-29213、ATCC-43300培养基中添加不同浓度的苯唑西林钠（2～512 μg/mL），于37℃温箱中培养6 h，观察细菌的生长情况。以培养基不发生浑浊，或OD值为阴性对照组OD值10%以下表示细菌增殖被抑制。

1.2.2 牛角地黄汤对金葡菌的苯唑西林钠耐受性的影响

以只加苯唑西林钠溶液的细菌培养组为阳性对照组，以不含药的细菌培养组为阴性对照组，以含牛角地黄汤的MHB培养基为药物对照组、试验组给予牛角地黄汤（2.5、5、10 mg/mL）和不同浓度的苯唑西林钠（2～512 μg/mL）溶液（见表 1），接种金黄色葡萄球菌ATCC-29213，37℃温箱中培养6 h，观察细菌的生长情况。

表1 试验组处理方案Table 1 Treatment scheme of test group

1.2.3 牛角地黄汤对金葡菌基因转录组学分析

过夜培养金黄色葡萄球菌，测OD值，并稀释到OD600=0.5时，分装菌液于4个试管中，加入不同浓度的牛角地黄汤（0、2.5、5、10 mg/mL），继续在 37℃，150 rpm摇床中培养，5 h后收集菌体，液氮保存，送到华大基因进行RNA提取及转录组学检测。

常规方法提取样品总RNA后，用试剂盒去除rRNA后进入下一步。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后去除 dNTPs后，加入缓冲液、dATP，dGTP，dCTP，dUTP、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用UNG酶消化第二条cDNA链，连接产物经MiniElute PCR Purification Kit纯化后，进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeq2000进行测序。获得的数据经数据处理去除含adaptor的reads，去除N的比例大于10%的reads，去除低质量reads（质量值Q≤20的碱基数占整个read的40%以上）.获得Clean reads，选择foldchange＞2的基因为差异表达基因，以S.aureus NCTC8325的基因组为参考基因组，将这些差异表达的基因同参考基因组进行比对，利用cluster软件，对差异表达基因和实验条件同时进行等级聚类分析。

1.2.4 金黄色葡萄球菌抗性相关基因表达分析

过夜培养金黄色葡萄球菌至OD600=0.5，分装于5个试管中，加入不同浓度的牛角地黄汤剂（0、2.5、5、10 mg/mL），继续培养5 h，分别取经离心的各组菌悬液，用PBS清洗3遍，分别向菌体沉淀中加入80 μL的TE缓冲液，震荡悬浮，加入终浓度为50 μg/mL的溶菌素及10 mg/mL的溶菌酶，于37℃水浴锅中水浴10 min，然后加入Trizol抽打混匀，按照程序提取mRNA，并立即检测RNA纯度和浓度。

应用康为世纪HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒（CW0744）将RNA反转录为cDNA，-20℃保存，选取合适引物（见表1）做PCR反应，PCR循环基本条件：第一阶段95℃预变性2 min，第二阶段95℃变性 30 s，50～55℃退火 15 s，72℃延伸 30 s，进行30次循环，最后72℃延伸5 min。所有样品均为三个平行，以16S rRNA为内参，采用电泳条带灰度分析作为基因的相对表达水平。目的基因相对表达水平=目的基因灰度值/16s灰度值

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌对苯唑西林钠耐受性的结果

金葡菌ATCC-29213与金葡菌ATCC-43300在2～512 μg/mL苯唑西林钠不同浓度的作用下，均有菌株生长（见图1），且在低于512 μg/mL浓度时细菌的存活率均高于10%，说明这两株金葡菌对苯唑西林钠都具有耐药性，金葡菌ATCC-29213比ATCC-43300菌株的耐药性更强。在后续的试验中选择金葡菌ATCC-29213为试验菌株。

图1 金黄色葡萄球菌对苯唑西林耐受性检测Figure 1 The tolerance test of Staphylococcus aureus to oxacillin

2.2 牛角地黄汤对苯唑西林钠抑菌作用的影响

苯唑西林浓度为512 μg/mL时金葡菌仍可生长，MIC高于512 μg/mL，表明其对苯唑西林具有耐药性。当加入牛角地黄汤后苯唑西林在256 μg/mL和512 μg/mL的培养孔中金葡菌的增殖明显被抑制金葡菌的存活率菌小于10%，在苯唑西林钠浓度为128 μg/mL 时，高剂量的牛角地黄汤（20 mg/mL）对金葡菌的增殖抑制作用最强，存活率低于10%。在苯唑西林钠浓度低于128 μg/mL时，金葡菌的增殖活性随着牛角地黄汤的浓度增高而显著降低，与不加牛角地黄汤的对照组差异显著（P＜0.05，图 2）。结果提示牛角地黄汤能增加耐药金葡菌ATCC-29213菌株对苯唑西林钠的敏感性，而且随着牛角地黄汤的浓度增高，金葡菌的增殖被抑制得更加明显。

图2 牛角地黄汤对金黄色葡萄球菌ATCC-29213耐药性的影响Figure 2 The effect of Niujiaodihuang decoction on the drug resistance of Staphylococcus aureus ATCC-29213

2.3 牛角地黄汤对金葡菌的转录组学分析

牛角地黄汤作用5 h后与对照组相比sRNA预测靶基因差异表达结果见图3。在2.5 mg/mL浓度时差异sRNA靶基因上调的基因为338，下调的基因为210个，在5mg/mL浓度时上调的sRNA靶基因为204，下调的sRNA靶基因为319个，在10 mg/mL浓度下上调的sRNA靶基因为474，下调的sRNA靶基因为347个。聚类分析（见图4）显示这些基因参与广泛的生物学功能，包括增殖、黏附、细胞周期、细菌感染、细菌抗性以及各种糖、脂肪的代谢途径等。

图3 预测差异sRNA靶基因统计Figure 3 Prediction of differential target genes sRNA statistics

图4 牛角地黄汤处理后金葡菌转录组学差异基因功能聚类分析Figure 4 Niujiaodihuang decoction treatment of Staphylococcus aureuspost transcriptome analysis of differential gene function clustering

根据信号通路分析结果，发现牛角地黄汤对金葡菌细胞周期及细菌抗性相关基因的表达有明显的影响。牛角地黄汤参与细胞周期相关基因ClpP的上调和FtsQ、MurG的下调，根据细胞周期信号通路分析ClpP基因的上调可抑制细胞进入染色体复制准备期G0期，MurG基因和FtsQ基因的下调可以抑制细胞进入G2/M期[15]，从而使金葡菌的增殖受到影响。glmU、murG基因与细菌细胞壁合成相关，在牛角地黄汤对金葡菌的抗生素抗性基因分析显示，牛角地黄汤在浓度为2.5 mg/mL时，MurG基因上调，在浓度为10 mg/mL时，MurG基因下调，该研究结果提示，牛角地黄汤可能具有影响金葡菌细胞壁的合成作用。

2.4 金黄色葡萄球菌抗性相关基因表达分析

2.4.1 牛角地黄汤对金葡菌细胞壁合成相关基因表达的影响

牛角地黄汤药物处理金黄色葡萄球菌后，提取mRNA反转录得到不同处理组金葡菌的cDNA，以此为模板进行PCR来检测抗性相关基因的表达。所有样品均为三个平行，以16S作为内参（见图5）进行灰度扫描检测。

图5 不同浓度牛角地黄汤处理的金葡菌16s PCR电泳图Figure 5 16s PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

glmU、murG基因是与细菌细胞壁合成相关基因[16-17]，murG基因主要功能是编码金黄色葡萄球菌在合成细胞壁过程中的关键酶，当其表达增高时，可有效地改变金葡菌细胞壁的结构，增加细胞壁厚度。牛角地黄汤处理后金葡菌murG、glmU基因的表达量呈现下降趋势（见图6）。这提示牛角地黄汤可能对金葡菌的细胞壁合成有影响。pbpB是细菌细胞壁合成所必需的也是苯唑西林的作用位点[18]，但是，牛角地黄汤对青霉素结合蛋白pbpB的mRNA的表达没有显著的影响（见图6）。

图6 不同浓度牛角地黄汤处理的金葡菌murG、glmU、pbpB基因PCR电泳图Figure 6 murG，glmU and pbpB genes PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

2.4.2 牛角地黄汤对金葡菌毒素及耐药相关基因表达的影响

牛角地黄汤对耐药辅助基因femB的表达呈显著抑制作用，且具有浓度依赖性，当牛角地黄汤浓度达到20 mg/mL时，其表达量下降了60%。但对pbpBR的mRNA的表达没有显著的影响（见图7）。牛角地黄汤对金葡菌杀白细胞毒素pvL基因的表达，没有显著影响（见图8）。

图7 不同浓度牛角地黄汤处理的金葡菌femB and pbpBR基因PCR电泳图Figure 7 femB and pbpBR genes PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

图8 不同浓度牛角地黄汤处理的金葡菌pvL基因PCR电泳图Figure 8 pvL genes PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

3 讨论

一直以来，人们对于治疗细菌感染性疾病主要是应用抗生素，抗生素类药物主要通过干扰细菌的DNA、细胞壁以及蛋白质等重要的生命活动而抑杀细菌，病原微生物在这种选择性压力下，很容易通过基因突变、质粒转座或改变细胞壁的结构、代谢途径等方式获得针对不同抗生素的耐药性[19]。pbpB是细菌所必需的，在革兰氏阳性菌细胞壁合成过程中起着关键作用[18]，且与β-内酰胺类抗菌药物具有高亲和性，由于pbps种类繁多，当高亲和力的pbps被β-内酰胺类抗菌药物结合而失去功能时，pbpBa的存在仍能维持细菌的生长，成为耐药菌株。本研究提示亚抑菌浓度的牛角地黄汤与苯唑西林联合应用能显著提高金葡菌对苯唑西林的敏感性。并且能参与众多的生命活动的调控。苯唑西林抑杀金葡菌的机制主要是作用于金葡菌的pbpB，通过影响菌体结构而抑杀细菌，因此我们重点关注了与细胞壁合成和耐药相关的基因，但并未发现牛角地黄汤对pbpB或pbpBR的影响，说明牛角地黄汤对细菌细胞壁的干扰作用的位点与苯唑西林不同，pbpB并非牛角地黄汤的作用位点，glmU、murG基因是与细菌细胞壁合成相关基因[16-17]，牛角地黄汤对细胞壁结构和细胞周期的干扰作用与murG和glmU基因转录有关，并且其能降低耐药相关基因femB的表达，这种作用可能是其与苯唑西林有协同作用的原因之一。在本次转录组中也发现牛角地黄汤能调控细胞膜蛋白的表达、使蛋白质的合成发生变化，糖类和脂肪类的转运和合成也受到控制，在代谢过程中氨基酸代谢过程发生改变，特别是对细菌Agr二元调控系统关键基因有显著下调，该系统与细菌的感染和致病力密切联系[20]，这与我们的前期研究发现牛角地黄汤在亚抑菌浓度作用下可抑制金葡菌ATCC-29213毒力因子如溶血素、肠毒素A和B的分泌的结果相一致。

中药在预防细菌感染方面有显著效果，单味中药在体外对痢疾志贺菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、病原性弧菌、大肠杆菌、伤寒沙门菌等具有较强的杀菌作用[21]，或具有逆转细菌耐药性的作用[22]。但是中药制剂十分复杂，药物的采集时间、煎制方法、药物之间相互作用，均可能对药物疗效产生一定影响，虽本研究研究推测牛角地黄汤可以与抗生素联合应用增加金黄色葡萄球菌的敏感性，提高抗生素的药效和抗感染作用，但是，在临床对于治疗细菌性感染是否有效，还有待进一步研究。