云南地方绵羊品种遗传多样性分子评价

梁家充，朱 兰，孙利民，杨红远，袁跃云，李东江，洪琼花*

（1.云南省畜牧兽医科学院/云南省畜禽遗传资源保护和种质创新工程实验室，昆明 650224；2.云南省家畜改良工作站，昆明 650223）

约9000年前，绵羊在近东地区被驯化后成为人类重要的家畜物种[1]。家畜繁育全球化的生产和竞争导致了许多本地品种在世界上消失[2]。联合国粮食与农业组织（FAO）估计，世界上已知的绵羊品种中有36%濒临灭绝或灭绝[3]。我国地方绵羊品种丰富，近年来，由于不合理地引种改良以及对地方绵羊种质资源缺乏保护，使地方绵羊品种的数量急剧减少[4]。因此，对地方绵羊品种的遗传多样性进行评估，是中国绵羊遗传资源保护的重要任务。云南省独特的地势结构、气候特征和多民族文化，决定了其具有丰富的生物多样性资源，是我国生物多样性的天然宝库。

微卫星（simple sequence repeat，SSR）是广泛分布于生物体的整个基因组中的简单重复序列，一般以2～6 bp的碱基为核心，重复几次至几十次[5]。由于这些标记具有高度多态性、共显性遗传性、保守性、基因组丰富性、选择性中性行为、易检测性和高重复性[6-9]，在品种遗传多样性分析、物种遗传图谱构建和种间遗传距离估测等方面具有重要的作用[10]。现已有多项研究成功地利用微卫星分子标记对家畜品种间的遗传多样性进行了描述[11-18]。

本研究采用具有高度多态的10个微卫星位点，对云南8个地方绵羊品种的遗传多样性和系统进化关系进行研究，为今后更好地开展资源保护和种质创新提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

本研究实验羊为迪庆绵羊（DQ）53只、兰坪乌骨绵羊（LP）59只、宁蒗黑绵羊（NL）60只、石屏青绵羊（SP）64只、腾冲绵羊（TC）61只、昭通绵羊（ZT）52只、丽江绵羊（LJ）60只和云南半细毛羊（BX）56只，共计8个绵羊品种465个样本。8个云南地方绵羊品种的来源地理分布如图1所示。抽取每只试验羊5 mL颈静脉血，置于EDTA抗凝采血管中，4℃保存备用。

图1 8个云南地方绵羊品种的来源分布Figure 1 Source distribution of 8 Yunnan native sheep breeds

1.1.2 主要试剂

乙二胺四乙酸二钠（EDTA），盐酸、琼脂糖、氯化钠、氢氧化钠、无水乙醇、溴化乙锭、溴酚兰和甲醛等购自Promega公司；TaqDNA聚合酶和dNTP购自Takara生物工程有限公司；血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生物有限公司；微卫星荧光引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.3 引物设计

选择的10对微卫星引物序列由FAO提供，引物信息见表1。

表1 10对微卫星引物信息Table 1 10 pairs of microsatellite primers

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

按照试剂盒的使用方法提取465个样本血液的DNA。抽提的DNA于-20℃冷冻保存。对提取的基因组DNA，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察电泳结果。

1.2.2 微卫星PCR扩增检测

PCR 反应体系 20 μL：2×Taq PCR Mix 10 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物各 1 μL，用双蒸水补足20 μL。PCR反应程序：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，退火（根据各引物退火温度，见表1）30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸 5 min；4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测和12%聚丙烯酰胺电泳检测，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行荧光毛细管电泳和基因型测定。

1.2.3 数据分析

应用Popgene 1.31软件计算下列遗传多样性的指标：观察等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne），观测杂合度（Ho），期望杂合度（He），Nei's基因多样性（H），F-统计量变异系数（Fst）和 Shannon-Weaver指数（I）；应用POPGENE软件通过Fst进行地域的地理分布分析；应用程序pic-calc 0.6计算每个SSR的辛普森多样性指数，也被称为多态信息含量（PIC）；使用样本共有片段的相似矩阵进行聚类分析，基因型之间的遗传关系用基于数学平均数的非加权组平均法（UPGMA）确定，用 ntsys2.1软件实现；用 STRUCTURE2.3.4计算 8个绵羊品种的所属遗传群体。

2 结果与分析

2.1 SSR多态性变化

用10对微卫星荧光引物进行扩增的465只羊的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行荧光毛细管电泳，产生4 650个电泳结果。部分结果如图2所示。荧光毛细管电泳具有典型性峰形，易于判断，保证了本试验数据的可靠性。

图2 微卫星位点毛细管峰图Figure 2 Capillary peak diagram of microsatellite loci

10对微卫星引物对8个绵羊品种共计465份样本的多样性分析可检测到160个等位基因，469个基因型，各遗传多样性参数见表2。

表2 本研究中使用的10对微卫星位点在465份样本中的遗传参数Table 2 The genetic parameters of 10 microsatellite loci in 465 samples

观察等位基因数（Na）是基因分化最重要的指标之一，与群体、类型和地理位置直接相关。在465样本中，每一个位点的Na值从7到23不等，平均值为16，扩增的基因型数目从15到82不等，平均为46.9。每个位点的 Ne在 2.121 到 6.355 之间，平均值为4.304。在整个样本集里的160个等位基因中，44个（27.5%）是稀有的，频率低于 0.05。Shannon 信息指数（I）的值从 0.987 到 2.287，平均为 1.745，期望杂合度（He）和观察杂合度（Ho）分别从 0.529 到 0.844（平均值=0.739），0.319 到 0.741（平均值=0.619）。Nei’s基因多样性指数（H）范围从 0.529 到 0.843，平均为0.738。相对于遗传分化系数（Fst），这10个微卫星位点遗传变异指数的范围从0.045到0.194，均值是0.135。本研究每个微卫星的多态性信息量（PIC）值从 0.481 到 0.829，平均为 0.706，除 SRCRP5为中度多态基因座外，其余都为高度多态基因座。

2.2 不同绵羊种群的遗传多样性比较

每个群体的观察等位基因数（Na）平均范围从4.8 到 8.8，平均为 6.775（见表 3）。每个群体的 Ho各不相同从 0.430 到 0.693，平均为 0.620。平均 I，H，和PIC每个位点在人群中变化分别从0.916到1.612（平均=1.311），0.485 到 0.722（平均值为 0.640），以及 0.429 到 0.689（平均=0.594）。其中石屏青绵羊（SP）的序列为最低的遗传参数值；这一发现暗示了石屏青绵羊中样本间密切相关。腾冲绵羊表现出最高的遗传多样性，除了Ho值外，所有其他遗传参数都为最高值。

表3 10个微卫星位点在8个绵羊品种中的遗传参数Table 3 Genetic parameters of 10 microsatellite loci in 8 sheep breeds

2.3 Hardy-Weinberg平衡检测

Hardy-Weinberg平衡检测见表4，表中P值小于 0.05表示相应群体的基因座处于 Hardy-Weinberg不平衡状态。由表4可知，腾冲绵羊8个基因座均处于Hardy-Weinberg平衡状态；丽江绵羊有4个基因座处于Hardy-Weinberg不平衡状态；昭通绵羊有3个基因座处于Hardy-Weinberg不平衡状态；宁蒗黑绵羊，兰坪乌骨绵羊和迪庆绵羊有2个基因座处于Hardy-Weinberg不平衡状态；云南半细毛羊和石屏青绵羊有1个基因座处于Hardy-Weinberg不平衡状态。

表4 Hardy-Weinberg平衡检测群体各基因座P值Table 4 The Hardy-Weinberg P values of each gene locus in the population

2.4 基于聚类分析的遗传关系

由Popgene 1.31软件计算的8个绵羊群体的Nei氏遗传距离和Nei氏遗传相似度结果可以看出（如表5），8个绵羊群体的Nei氏遗传距离在0.090 7～0.767 0之间。其中，丽江绵羊和宁蒗黑绵羊的遗传距离最近，为0.090 7；石屏青绵羊和云南半细毛羊的遗传距离最远，为0.767 0。这与样本的地理来源分布一致（如图2）。

表5 8个绵羊群体的Nei氏遗传距离和Nei氏遗传相似度Table 5 Nei's genetic identity and genetic distance of 8 sheep population

UPGMA聚类分析结果如图3所示，8个绵羊品种聚为三大分支。丽江绵羊（LJ），宁蒗黑绵羊（NL），兰坪乌骨羊（LP），石屏青绵羊（SP）和昭通绵羊（ZT）为第一分支；迪庆绵羊（DQ）为第二分支；云南半细毛羊（BX）和腾冲绵羊（TC）为第三分支。

2.5 云南绵羊的群体遗传结构

使用 STRUCTURE 2.2.3 软件，通过贝叶斯聚类分析，评估了来自不同地区的465个样本的群体结构和分化。结果显示，当遗传组数量（K）为8时，Ln P[D]值达到最大（图4A）。由于数值变化率的ΔK能够比较准确地反映真正的K值，所以根据下列公式：

图3 8个绵羊品种的UPGMA聚类图Figure 3 The UPGMA Cluster graph of 8 sheep breeds

其中 L（K）即 LnP（D），s为标准差，m 为平均值，根据该公式可计算得出K与ΔK的折线关系图（图4B）。右图看出，K=8时，ΔK达到最大，表明这465个样本分别来自于8个种群。

图4 评估群体结构和分化Figure 4 Evaluate population structure and differentiation

在 K=8 时，STRUCTURE 2.2.3 软件分析作图（图5），表明分析组别与样本实际来源相符。

3 讨论与结论

微卫星的多态性能够反映物种的进化历史，群体中频率最高的等位基因是该物种中最原始、最保守的，其余的等位基因是进化过程中由该等位基因突变形成的。与许多其他的分子标记相比，SSRs有几个优点：它们很丰富，高度多态，共显性遗传，分析简单，易于转移。联合国粮食与农业组织（FAO）建议，在对家养动物进行遗传多样性检测时，每个品种检测的个体数量至少应达到25个个体，最好达到50个个体以上。在本试验中，每个群的样本含量分别都超过50只，达到了联合国粮食与农业组织建议检测的要求。

3.1 Hardy-Weinberg平衡分析

根据Hardy-Weinberg法则，在一个没有选择、突变和迁移的大交配群体中，基因频率和基因型频率在世代间保持不变。造成Hardy-Weinberg不平衡的原因可能有近交、杂交、选择作用、采样偏差和零等位基因的存在。在本研究结果中，8个群体，10个位点，总计80个基因座中，出现13个基因座表现出不平衡现象。推测可能造成这种情况的主要原因：一是采样的群体存在人工选择影响，群体数量少，分布相对集中；二是可能与群体内近交有关，因为羊群饲养的母羊较多，公羊少，羊群一般采用就近交配或是可能来源于同一头种公羊，群体很难做到随机交配，易造成基因丢失。这些都对群体的基因平衡产生了影响。

3.2 微卫星标记的多态性

多态信息含量（PIC）是衡量片段多态性的一个指标。D.Botstein等[19]提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，当PIC＞0.5时，该基因座为高度多态性，0.5＞PIC＞0.25 时为中度多态性，PIC＜0.25时为低度多态性。在本研究中的10个微卫星位点中，DYMS1位点的PIC平均值最高，达到0.829，SRCRSP5位点的PIC平均值最低，为0.481，其余位点的PIC平均值都在0.807～0.534之间，均为高度多态性位点。因此，除SRCRSP5基因座多态信息含量和杂合度均明显低于其他基因座，不适用于该种群的亲缘鉴定和个体识别外，其余基因座均有较高的个体识别能力，可在相关鉴定中选用。

3.3 品种内遗传多样性

PIC是评估一个群体遗传多样性的重要指标。王吉振等[20]利用4个微卫星对7个绵羊品种间的遗传关系进行研究，结果发现各品种的平均PIC值为0.55。常爽等[21]利用9个微卫星标记分析9个绵羊品种的PIC平均值为0.625。汤存伟等[22]利用10个微卫星标记对新疆13个绵羊品种进行遗传多样性分析，PIC的平均值为0.680 2。在本研究中的8个绵羊品种中，腾冲绵羊的PIC平均值最高，平均达到0.689；石屏青绵羊的 PIC 平均值最低，平均为 0.429，为中度多态；其余位点的PIC平均值都在0.537～0.656之间，均为高度多态性，与上述研究结果相近。表明本研究8个绵羊品种的遗传多样性较为丰富，具有较大的育种潜力，同时也反映出了当前各品种资源的状态良好。

期望杂合度（He）又称基因多样度，反映各群体在各位点上的遗传变异，被认为是度量群体遗传变异的一个最适参数。平均杂合度的大小可反映遗传结构变异程度的高低，杂合度越高说明该群体内的遗传变异越大，遗传多样性也就越丰富；反之则群体内的遗传变异小，遗传多样性匮乏。柴文琼等[23]利用5个微卫星标记得出5个品种的观察杂合度为0.448～0.680。吕慎金等[24]用 30 个微卫星标记得出 8个绵羊品种的观察杂合度为 0.539 0～0.71 35，与之前的研究结果相近。本研究结果表明，腾冲绵羊的He平均值最高，为0.729；云南半细毛羊的He平均值次之，为0.703；石屏青绵羊的He平均值最低，为0.489。说明腾冲绵羊遗传变异最大，遗传多样性最丰富，其次是云南半细毛羊、宁蒗黑绵羊、迪庆绵羊、兰坪乌骨羊、丽江绵羊和，昭通绵羊，最后是石屏青绵羊。

3.4 系统分化关系和遗传结果

UPGMA聚类分析结果显示，丽江绵羊（LJ）和宁蒗黑绵羊（NL）的遗传距离相近，与云南半细毛羊和腾冲绵羊的距离最远。丽江绵羊（LJ），宁蒗黑绵羊（NL），兰坪乌骨羊（LP），石屏青绵羊（SP）和昭通绵羊（ZT）为一大分支；迪庆绵羊（DQ）为一大分支类；云南半细毛羊（BX）和腾冲绵羊（TC）为另一大分支。结合图1的群体来源地理分布，怒江的兰坪乌骨羊，丽江的丽江绵羊和宁蒗绵羊地域接近，基因交流机会较多，遗传距离也就越近。而石屏的石屏青绵羊与怒江和丽江的这几个品种的绵羊遗传距离相近，说明石屏青绵羊可能曾经从该地引种。同样的可看出昭通绵羊也曾从石屏引种。昭通的云南半细毛羊为人工培育品种，遗传距离和腾冲的腾冲绵羊相近，说明云南半细毛羊可能从腾冲地区部分引种。而迪庆绵羊在海拔较高的迪庆，与周围地区的丽江和怒江的绵羊表现出不同程度的遗传多样性，说明它们存在一定的地理隔离。

群体遗传结构分析结果显示，如图5所示，丽江绵羊和宁蒗黑绵羊群体中对应的颜色有部分交换，说明这两个群体遗传距离相近，这与聚类分析的结果相一致。如图4B所示，当K=8时，ΔK达到最大，表明这465个样本分别来自于8个种群。这与本研究中绵羊样本实际采自8群体相符。

本研究结果表明 SRCRSP1、OarFCB304、OarJMP58、MAF33、DYMS1、ILSTS11、MAF214、CM140、ILSTS28可以作为有效的遗传标记用于绵羊品种的遗传多样性和遗传关系研究。腾冲绵羊、云南半细毛羊、宁蒗黑绵羊、迪庆绵羊、兰坪乌骨羊、丽江绵羊和昭通绵羊都具有较丰富的遗传多样性；腾冲绵羊遗传变异最大，其次是云南半细毛羊、宁蒗黑绵羊、迪庆绵羊、兰坪乌骨绵羊、丽江绵羊、昭通绵羊，石屏青绵羊变异最小；它们之间的遗传分化关系与品种的地域、起源、驯化和相互引种有关。