响应面法优化鲟鱼肝脏铁蛋白提取工艺

饶承冬，叶 浪，邓 静，白稚子，戴卓君，李沛隆，李树红，王彩霞，张志清，陈安均，刘兴艳，申光辉，吴贺君，罗擎英，黎杉姗，苏 赵，李美良

（四川农业大学食品学院,四川雅安 625014）

1937年，Laufberge首次从马的脾脏中分离纯化出铁蛋白（Ferritin），并继而发现动物、植物、微生物体内均广泛地存在铁蛋白[1]。铁蛋白作为一种球形分子，由蛋白壳和铁核两部分构成，其分子质量为450kD，具有很好的酸碱稳定性和热稳定性[2]。研究发现，铁蛋白是一种新型的天然补铁制剂，它具有调节生物体内铁代谢平衡的生理功能，使机体内的铁元素保持一种可溶、无毒且生物可利用的状态，可有效缓解铁缺乏症[3-4]。

鲟鱼（Sturgeon）又称鲟龙，属鲟形目，是一类原始古老的软骨硬鳞鱼类[5]。我国是一个鲟鱼养殖大国，据统计，2016年，我国的鲟鱼产量达到了8.9万吨[6]，因其特有的经济价值、营养价值和生物学特性而备受关注。国内外相关研究人员对鲟鱼的研究主要集中在其肌肉、鱼卵、软骨等几方面[7-9]。鲟鱼在加工成产品之后，往往会产生大量的下脚料，如鱼肠、肝脏、鱼皮等，如何将这些废弃物加以综合利用成为近年来的研究热点，倍受养殖业关注。

目前，对于铁蛋白的研究主要集中在性质研究方面，对于提取方法的研究报道较少。本文旨在采用单因素分析结合响应面法探讨从鲟鱼肝脏提取铁蛋白的最佳工艺，为鲟鱼肝脏的资源开发提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

试剂：西伯利亚鲟鱼肝脏：由四川润兆食品有限公司提供，保存于-20℃ ； 菲 啰 嗪，KH2PO4，NaOH，Tris，HCl，以上试剂均为分析纯，购于成都科龙化工试剂有限公司。

仪器：E-201-95型pH计（上海佑科仪器仪表有限公司）；TGL 16M高速冷冻离心机（湖南湘智离心机有限公司）；SORVALL Legend MICRO 17酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；FA1204B型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；HH-8型数显水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；ULUP-IV-10T超纯水机（成都超纯科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 鲟鱼铁蛋白的提取

将鲟鱼肝脏于4℃条件下解冻后，除去脂肪组织并切碎，加入适量缓冲液于组织捣碎机中搅碎；然后4℃、10 000 r/min离心20 min，过滤除去沉淀和上层脂肪，收集中间层清液。

将收集的清液于60～75℃水浴加热20min，以使非耐热蛋白变性沉淀；加热完毕，迅速冷却至室温，再次对样品进行多次离心处理（4℃，10 000 r/min），每次20 min，收集上清液。按照一定饱和度，向上清液中加入硫酸铵，并于4℃条件下放置过夜，让铁蛋白沉淀析出。在4℃下，以10 000 r/min将上清液离心20 min，除去上清，收集红色沉淀，并用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）溶解。置于透析袋内，用超纯水透析过夜，除去硫酸铵和其他盐，取透析液备用。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 缓冲液种类对铁蛋白提取率的影响

在其他提取条件相同的情况下，分别使用相同摩尔浓度和pH的Tris-HCl溶液和KH2PO4-NaOH溶液提取铁蛋白，探究不同缓冲液种类对鲟鱼肝脏铁蛋白提取率的影响。

1.2.2.2 缓冲液pH对铁蛋白提取率的影响

在其他提取条件相同的情况下，分别使用不同pH（7、7.5、8、8.5、9）的 KH2PO4-NaOH 溶液提取铁蛋白，探究不同缓冲液pH对鲟鱼肝脏铁蛋白提取率的影响。

1.2.2.3 料液比对铁蛋白提取率的影响

在其他提取条件相同的情况下，探究在不同料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）条件下，鲟鱼肝脏铁蛋白的得率。

1.2.2.4 处理温度对铁蛋白提取率的影响

在其他提取条件相同的情况下，使用不同的温度（60℃、65℃、70℃、75℃）处理第一次离心之后收集的清液，探究不同的温度处理对鲟鱼肝脏铁蛋白提取率的影响。

1.2.2.5 硫酸铵饱和度对铁蛋白提取率的影响

在其他提取条件相同的情况下，分别使用不同饱和度的硫酸铵（30%、40%、50%、60%、70%、80%）沉淀铁蛋白，探究不同饱和度硫酸铵对鲟鱼肝脏铁蛋白提取率的影响。

1.2.3 响应面优化实验

如表1所示，根据单因素实验结果，选择料液比（X1）、硫酸铵饱和度（X2）、pH（X3）为影响因子，将铁蛋白提取率作为响应值，进行3因子3水平的响应面试验设计，利用Design-Expert 8软件优化分析。

表1 响应面试验编码和参数Table 1 Coded values and corresponding values of response surface methodology

1.2.4 提取液中铁含量的测定

参照杨秀丽[10]的方法，使用Ferrozine试剂法测定Fe浓度。用微量移液器量取20 μL粗铁蛋白溶液，加入250 μL 30%三氯乙酸，再加入730 μL超纯水摇匀，将上述混合液在4 000 g离心1 min。离心后取700 μL上清液于新的离心管中，依次加入100 μL饱和乙酸铵，62.5 μL 0.12 mol/L 抗坏血酸，62.5 μL 0.25 mol/LFerrozine，最后加入 75 μL 超纯水，震荡摇匀。室温下反应4 h后，在562 nm下测定吸光值，得到吸光值A562，即可表示铁含量的多少。

1.2.5 总蛋白的测定

采用Lowry[11]法测定样品蛋白含量，具体测定方法参照试剂盒使用说明书。

2 结果与分析

2.1.1 缓冲液种类对铁蛋白提取率的影响

由图1可知，使用KH2PO4-NaOH缓冲液提取铁蛋白，其得率高于使用相同摩尔浓度和pH的Tris-HCl缓冲液的提取率，因此本实验将KH2PO4-NaOH作为铁蛋白提取缓冲液。

图1 不同缓冲液对铁蛋白提取率的影响Figure 1 Effect of different buffers on the extraction rate of ferritin

2.1.2 缓冲液pH对铁蛋白提取率的影响

由图2可知，使用相同摩尔浓度的KH2PO4-NaOH缓冲液提取铁蛋白，其提取率随着缓冲液pH的增加呈先上升后下降的趋势，当缓冲液pH值为8时，铁蛋白提取率达到最大值，因此选择8作为最适提取pH值。

图2 缓冲液pH对铁蛋白提取率的影响Figure 2 Effect of buffer pH on the extraction rate of ferritin

2.1.3 料液比对铁蛋白提取率的影响

由图3可知，使用相同的缓冲液提取铁蛋白，随着料液比的增加，铁蛋白的提取率也逐渐增加，在料液比超过1∶4之后，提取率增加的幅度减缓，说明一定的缓冲液量有利于鲟鱼肝脏中铁蛋白的溶出，但是增加缓冲液的量会增加后续处理的工作量。因此选择1∶4（w/v）为最佳提取料液比。

图3 料液比对铁蛋白提取率的影响Figure 3 Effect of solid to liduid ratio on the extraction rate of ferritin

2.1.4 热处理温度对铁蛋白提取率的影响

清液经过加热处理，可以使一些非耐热蛋白变性沉淀，经过再次离心除去，可以减少杂蛋白的含量，有利于后面纯化工作的进行。由图4可知，随着热处理的温度上升，虽然可以使提取液的杂蛋白减少，但是高温（＞65℃）条件下，也会使部分铁蛋白变性失活，从而降低了提取率，当温度为65℃的时候，铁蛋白的得率最高，而杂蛋白也较少；在温度低于65℃的时候，虽然铁蛋白的得率较高，但是溶液中混合的杂蛋白也相对较多，将会对铁蛋白后续的纯化处理工作增加一定难度。综合考虑，选择65℃热处理，提取的效果最佳。

图4 热处理温度对铁蛋白提取率的影响Figure 4 Effect of heat treatment temperature on extraction rate of Ferritin

2.1.5 硫酸铵饱和度对铁蛋白提取率的影响

由图5可知，沉淀时随着添加硫酸铵的饱和度的增加，其铁蛋白的提取率逐渐增加，当饱和度超过50%时，随着硫酸铵饱和度的增加，铁蛋白的提取率没有明显的变化，这可能是因为，当硫酸铵饱和度为50%时，几乎所有的铁蛋白都沉淀析出了。因此选择50%为最佳硫酸铵沉淀饱和度。

图5 硫酸铵饱和度对铁蛋白提取率的影响Figure 5 Effect of ammonium sulfate saturation on extraction rate of Ferritin

2.2 响应面优化试验

2.2.1 试验设计与结果

根据单因素实验结果，选择料液比（X1）、硫酸铵饱和度（X2）和 pH（X3）为自变量，铁蛋白提取率（Y）为响应值，采用Design Expert 8软件对试验进行响应面设计，结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

2.2.2 试验拟合分析

试验拟合结果如下：

由表3可知，该模型R2=97.10%，失拟项不显著（P=0.091 4＞0.05），回归模型极显著（P=0.002 5＜0.01），说明该模型与实际试验拟合度较好；从F值可以得出，料液比、硫酸铵饱和度、pH对实验的影响大小为：X3＞X1＞X2，其试验结果与一些学者的研究相一致，辛敏等[12]采用响应面法优化鹰嘴豆铁蛋白提取工艺，得到各因素影响大小为：缓冲液pH＞料液比＞盐析盐摩尔浓度；刘文营[13]从鹰嘴豆中提取铁蛋白，通过对pH值、盐梯度的三水平的考察，得到提取缓冲液pH对铁蛋白提取率的大小有一定的影响。因此，可以用此模型对鲟鱼肝脏铁蛋白提取的工艺条件进行很好的预测。

表3 铁蛋白提取率的响应面二次模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic regression equation of Ferritin extraction rate

2.2.3 响应面和等高线分析

响应面可以描述各变量间的相互作用、预测因素的最优条件值[14]。各自变量交互作用对铁蛋白提取率影响的响应面与等高线见图6～图8。

由图6可知，X1和X2交互影响，铁蛋白的提取率随X1和X2的变化较平缓，此外，在其等高线图中，等高线沿X1轴变化的趋势与X2轴的变化大体相同，据此推测，X1和X2对铁蛋白提取率没有显著影响。

图6 料液比与硫酸铵饱和度对响应值的影响（×10-5）Figure 6 Effect of liduid to solid ratio and ammonium sulfate saturation on response values

根据图7，铁蛋白的提取率随着X3的增加，表现出先增加后降低的趋势，有最大值；响应面坡度随X1的变化较小，在其等高线图中，等高线随X3轴变化的趋势明显大于X1轴。因此，X1影响铁蛋白提取率的显著性小于X3。

图7 料液比与pH对响应值的影响（×10-5）Figure 7 Effect of liduid to solid ratio and pH on response values

根据图8，铁蛋白的提取率随着X3的增加，表现出先增加后降低的趋势，有最大值；响应面坡度随X2的变化较小，在其等高线图中，等高线X3轴变化的趋势明显大于X2轴。因此，X2影响铁蛋白提取率的显著性小于X3。

图8 硫酸铵饱和度与pH对响应值的影响（×10-5）Figure 8 Effect of ammonium sulfate saturation and pH on response values

综上，比较三个因素的两两交互作用图，pH对鲟鱼肝脏铁蛋白提取率的影响较大，表现为在选定的取值区间内曲面响应变化大，这与回归模型方差分析中的一次项X3（P＜0.01）结果相一致。

2.2.4 验证试验

通过响应面优化试验，获得铁蛋白最佳提取条件为：料液比 1∶3.81，硫酸铵饱和度 56.90%，缓冲液pH值8.12，此时铁蛋白的提取率为0.003386%。根据实际情况，将提取条件微调为料液比1∶3.8，硫酸铵饱和度57%，缓冲液pH值8.12。按照调整后提取条件进行3次验证试验，结果铁蛋白的得率0.003 295%，与预测值偏差小，表明响应面法可以用于优化铁蛋白的提取工艺。

3 讨论与结论

响应面法为多元二次回归方法，可以减少试验次数，大大降低试验工作量，并可比较影响因子之间交互作用；通过对响应面建立的模型进行优化求解，可提出试验优化方案，解决响应面法在试验设计与优化的实际应用中遇到的问题[15]。目前，该方法经常用于对多肽[16]、多糖[17]、黄酮[18]等物质的提取工艺及一些食品加工工艺[19]进行优化。

由于铁蛋白特殊的结构和功能，其逐渐成为相关领域的研究热点之一。目前对铁蛋白在基因、分离纯化和含量测定方法、铁释放动力学、纳米材料的制备等方面的研究都有了很大的进展。李忻怡等[20]对青岛文昌鱼铁蛋白ferritin基因的序列和一级结构进行了分析，并对其二级结构进行了预测，为文昌鱼铁蛋白ferritin和研究该分子的功能提供了参考。王群力等[21]魟 魟选取 鱼肝脏为研究材料，研究 鱼铁蛋白释放铁的动力学过程和规律，结果认为铁蛋白释放铁的过程均受到蛋白壳自身柔性调节速率的影响。对于水产品来源的铁蛋白的提取工艺报道较少，本试验采用响应面法优化鲟鱼肝脏铁蛋白提取工艺，选取的因素对铁蛋白影响的大小为：pH＞料液比＞硫酸铵饱和度，其原因可能是缓冲液中的H+和OH-影响了铁蛋白表面电荷的平衡，从而有利于铁蛋白的溶出。与辛敏[12]和刘文营[13]等从鹰嘴豆中提取铁蛋白优化工艺因素影响大小相一致，虽然物种不同，铁蛋白提取率各有差异，但实验结果表明，缓冲液pH值的大小对铁蛋白的提取率的影响较其他因素的影响具有显著性。

实验通过对鲟鱼肝脏铁蛋白提取工艺进行报道，以期为水产品铁蛋白的相关研究提供一定参考。