酱香型白酒酿造中放线菌多样性及功能研究概述

王珂佳，邱树毅*

（1.贵州轻工职业技术学院 轻工化工系，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；4.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

酱香型白酒是我国特有的传统白酒，以贵州茅台酒和四川郎酒为主要代表，其酿造历史可追溯至秦汉时期，经不断发展，形成了以高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温流酒、生产周期长和贮存时间长为特点的“四高两长”生产工艺[1-2]。酱香型白酒发酵过程涉及细菌、霉菌和酵母菌等各种微生物共同作用[3]，其中，细菌是产香动力来源、霉菌是糖化动力来源、酵母菌是发酵产酒精和产高级酯类动力来源[4]，放线菌的次生代谢产物在酱香型白酒酿造过程中具有一定的生物调控作用[5]。

放线菌（actinomycetes）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物，属于革兰氏阳性、化能异养型细菌[6]，含有大量鸟嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C），因其呈放射状生产而得名，以孢子繁殖和断裂生殖，大多数菌种均能耐高温，在自然界中广泛分布于热泉、高温堆肥中[7-8]，迄今已发现和形态描述放线菌约3 000余种，代表属有链霉菌属（Streptomyces）、诺卡氏菌属（Nocardia）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）、小单孢菌属（Micromonospora）等[9]。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，被广泛报道为抗生素的来源[10-11]，同时，放线菌还能产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等各种酶及维生素B12（vitamin B12，VB12）和有机酸等，此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面[12-14]。近年来，针对酱香型白酒酿造中放线菌的分离筛选研究不断见诸报道[4-5，15]，为开展酱香型白酒酿造中放线菌多样性研究奠定了基础；同时，对于放线菌在酱香型白酒酿造中功能研究也取得了一定成果。本文围绕酱香型白酒酿造中放线菌多样性及其功能，综述了酱香型白酒酿造过程中放线菌的研究现状，分析了放线菌在酱香型白酒酿造过程中次生代谢产物对酱香风味形成影响及生物调控的作用机制，展望了白酒中放线菌未来研究前景，为今后开发高温放线菌资源及功能，提升酱香型白酒品质奠定基础。

1 酱香型白酒酿造中放线菌多样性研究

酱香型白酒是在开放环境中，基于“多微共酵”的固态发酵方式进行生产[16]，其独特的制曲和制酒工艺需将温度控制在较高水平，各种酿酒微生物经过长期高温驯化，大量耐高温菌株得以富集[17]。目前，研究人员在酱香型白酒酿造过程中发现的放线菌绝大多数为高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae），该科共有14个属，分别为高温放线菌属（Thermoactinomyces）、黄色高温微杆菌属（Thermoflavimicrobium）、清野氏菌属（Seinonella）、莱斯氏属（Laceyella）、直丝菌属（Planifilum）、迈勒吉尔霉菌属（Melghirimyces）、岛津氏菌属（Shimazuella）、链孢子菌属（Desmospora）、徐氏菌属（Lihuaxuella）、海洋丝状菌属（Marininema）、皂-洛克菌属（Mechercharimyces）、克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）、多分枝霉菌属（Polycladomyces）和海森氏菌属（Hazenella）[18]。

1.1 酱香型白酒制曲发酵过程中放线菌多样性研究

俗话说“，曲为酒之骨”，曲是白酒酿造主要的糖化剂和发酵剂，为白酒酿造提供丰富的菌源和可利用的熟淀粉，促进原料边糖化边发酵，对白酒香型形成具有重要作用。酱香型白酒酿造所使用的是以纯小麦为原料加入母曲，在65℃条件下经60 d左右固态自然发酵所形成的高温大曲。在开放式的制曲过程中，来自空气、水、原料、器具和场地环境等方面的微生物富集在大曲中，形成复杂而多样的微生物体系，主要包括细菌、霉菌和酵母菌[1，3]。目前，针对酱香型大曲中放线菌多样性研究逐渐受到重视。

20世纪80年代，沈阳市食品发酵研究所对茅台酒厂、长沙酒厂、常德酒厂及吴川酒厂所使用酱香大曲在培养过程中微生物消长情况进行研究，其结果表明，放线菌的数量均多于霉菌[19]。1992年，中国科学院成都生物研究所在凉山州曲酒厂的酱香型酒曲中，分离出较大数量的高温放线菌[20]。高亦豹[21]采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术（polymerase chain reaction-denaturing gradientgelelectrophoresis，PCR-DGGE）研究中国白酒大曲微生物群落结构过程中，检测到Thermoactinomyces sanguinis属于高温放线菌属。2001-2006年，范光先等[22]对茅台酒制曲发酵过程中微生物的消长情况进行了研究，共分离得到微生物97种，其中放线菌4种。王晓丹等[23]采用Roche454 FLX+高通量测序平台对贵州3种酱香型白酒高温大曲中细菌类群组成进行了研究，发现高温放线菌属在3种酱香大曲中均为优势菌属，含量均超过34%，最高达到66.10%。王芙蓉等[24-25]利用GTY培养基和ISP2培养基从酱香型大曲中成功分离得到1株放线菌F6，经鉴定菌株F6为普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）。尤小龙[26]从酱香型白酒酿造过程中成功分离出25株放线菌，其中，10株分离自大曲，大曲中放线菌数量与窖皮泥中一致且大于酒醅。罗小叶等[27]在28℃条件下先干热处理再湿热处理对样品进行预处理后分别利用高氏一号培养基、ISP2培养基、淀粉-甘油培养基从茅台大曲中分离出3株放线菌，其中菌株FBKL4.001、FBKL4.002鉴定为可可链霉菌（Streptomyces cacaoi）、菌株FBKL4.003鉴定为沙阿霉素链霉菌（Streptomyces zaomyceticus）。李豆南等[28]从酱香型大曲中成功分离得到1株具有耐高温特性的放线菌FBKL4.005，经全基因组测序和序列分析发现菌株FBKL4.005拼接基因组在属水平上与现有的链霉菌属（Streptomyces sp.）基因组核酸序列相似性在57.50%左右，总体相似度最高；而在种水平上则与吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）具有14.82%最高相似性。同时，还发现一株耐热性良好的放线菌FBKL4.010，通过形态学、生理生化特征鉴定、16S rRNA基因序列分子生物学鉴定，确定该菌株归属于高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae）莱斯氏菌属（Laceyella sp.），经过进一步系统发育树比对分析鉴定为糖莱斯氏菌（Laceyella sacchari）[3]。

目前，使用传统纯培养方法在酱香型大曲中仅能发现少数的放线菌，而利用基于现代分子生物学技术的免培养法则发现许多未培养高温放线菌，且与芽孢杆菌一样为主要的优势菌群。同时，也建立了从酱香大曲中有效分离筛选放线菌的方法，为研究酱香型大曲中放线菌多样性及其功能奠定了基础。

1.2 酱香型白酒制酒发酵过程中放线菌多样性研究

酱香型白酒在制酒过程中需经8轮次发酵，每轮次包含高温堆积发酵和入窖发酵两个环节，为期1个月。第1轮次称为“下沙”，加总量50%的高粱和投料量12%的大曲、第2轮次称为“糙沙”，加总量剩余50%的高粱和适量大曲，第3～8轮次称为“回沙”，只加大曲不再投料[2]。在整个制酒发酵过程中，大曲与高粱混合发酵制成的酒醅、发酵池中窖泥以及环境中所包含的微生物共同作用对酱香型白酒风味的形成产生影响。近年来，研究者们在从酱香型大曲中成功分类鉴定出具有生物学功能的放线菌基础上，将研究范围从大曲扩展到酒醅、窖泥，并取得了一定成果。

1981年，崔福来等[19]采用平板稀释法从酱香型武陵酒第六轮发酵的酒醅中发现了少量放线菌存在。2001-2006年，贵州茅台酒厂技术中心对茅台酒制酒堆积发酵和入窖发酵过程中微生物多样性进行了研究，从酒醅中分离得到微生物85种，其中细菌41种，酵母28种，霉菌16种，未发现放线菌存在[22]。2014年，黄治国等[29]利用传统的分离纯化技术和Biolog自动微生物鉴定技术，首次从酱香型白酒酒醅中分离纯化得到一株伴放线菌嗜血菌。2014年，程才璎等[30]运用PCR-DGGE技术对酱香型白酒连续七轮次堆积前期、堆积中期、堆积后期酒醅细菌群落结构进行了研究，克隆测序分析结果表明，酱香型白酒酒曲细菌群落结构多样性高于所有堆积酒醅。高温放线菌属（Thermoactinomycetaceae）是酒曲和所有堆积酒醅样品中共有的优势菌群之一，链霉菌属（Streptomyces）是酿酒酒质最好的第三、四、五轮次酒醅中共有的优势菌群之一。2016年，尤小龙[26]从酱香型白酒生产过程中所使用的大曲、酒醅、窖皮泥中成功分离出25株放线菌，其中，5株分离自酒醅，10株分离自窖皮泥，且窖皮泥中的放线菌数量与大曲中一致。2017年，白成松等[31]从茅台地区酱香型酒糟中筛选出一株耐高温放线菌株，通过16S rDNA基因序列分析以及系统发育树分析，鉴定为产色高温单孢菌（Thermomonospora chromogena）。2017年，韩兴林等[32]采用高通量测序技术对酱香白酒高温堆积酒醅中原核微生物结构进行了系统分析，共检出马杜拉放线菌属（Actinomadura）、白蚁菌属（Isoptericola）、考克氏菌属（Kocuria）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）等11个高温放线菌属。2017年，黄蕴利等[33]通过IlluminaM iSeq平台研究分析酱香型白酒第二轮次发酵过程生产堆积、窖池发酵酒醅中的微生物多样性及其主要功能群落结构，结果表明在堆积酒醅中存在少量高温放线菌属，占比1.37%。

在酱香型白酒酿造过程中，放线菌在酒醅中的含量较少，远低于大曲中的含量水平，且利用传统纯培养方法分离鉴定难度大，灵敏度不高。高通量测序等现代检测技术的发展，促进了酒醅中放线菌的深入研究。

放线菌大部分属于土壤放线菌，在酱香型白酒酿造过程中，经研究表明其在窖皮泥中含量与大曲中相当，但是目前针对窖皮泥中放线菌的研究屈指可数，尚未引起研究者们的重点关注。

1.3 酱香型白酒酿造环境中放线菌多样性研究

酱香型白酒是在开放性环境中进行生产的，环境中的微生物是酱香酒生产微生物的重要来源，无论是高温制曲，高温堆积发酵还是入窖发酵，都会网罗环境微生物参与其中。放线菌主要分布在土壤和空气中，因此对于酿造环境中放线菌多样性的研究也是一个重点领域。

2003年，蒋红军[34]研究发现，在茅台酒生态环境中放线菌尽管数量少，但也是酿造微生物中的一大类。2004-2006年，贵州茅台酒厂技术中心对茅台镇周边的土壤、水源及空气中的微生物进行了普查，分离检测到147种微生物，至少50种与茅台酒生产过程中发现的微生物种相同，其中放线菌有4种[22]。2014年，杨帆等[35]利用高氏平板从酱香型白酒生产环境土壤中筛选分离得到1株放线菌NS01，利用形态学、16S rRNA序列同源性鉴定目的菌株为链霉菌属（Streptomyces sp.）。2014年，张亚丽[36]通过对贵州省仁怀地区茅台镇空气微生物进行鉴定与分析发现，酱香型白酒在酿造过程中有很大一部分微生物来自于所处的空气环境中，采用固体撞击法对贵州省仁怀市茅台古镇已选定的5个采样点进行空气微生物采集，经培养共分离鉴定微生物800余株，300余种，其中包括霉菌、放线菌等。

环境中微生物菌群在酱香型白酒制曲、制酒生产中，对酱香风味形成具有一定影响，但目前对酱香型白酒酿造环境中微生物研究相对较少，主要集中在芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）等细菌和嗜热真菌属（Thermomyces）、曲霉属（Aspergillus）、热子囊菌属（Thermoascus）等霉菌上[36-39]，且程度不深，对于细菌中放线菌更是未被重视。因此，对酱香型白酒酿造环境中微生物多样性进行深入研究，开展放线菌相关研究，为保证酱酒品质提供更丰富的理论支撑。

2 酱香型白酒酿造中放线菌功能研究

作为一类重要的酿造微生物，相关研究表明放线菌的次生代谢产物在白酒酿造过程中具有一定的生物调控作用[40]。

2.1 放线菌次生代谢产物对于酱香风味形成的研究

酱香型白酒独特风味是基于特殊的生产工艺和地理环境下多种微生物协同作用形成的，作为酱香型白酒酿造过程中的重要微生物菌群，研究放线菌次生代谢产物在酱香风味形成方面的作用机制具有重要意义。

尤小龙等[5]通过液相色谱-质谱联用（liquid chromatographmasspectrometrometry，LC-MS）和衍生化后高效液相色谱技术，对从酱香型白酒生产过程分离出的白色链霉菌（Streptomycesalbus）S5的代谢产物进行研究，结果表明：其所代谢出的具有生物活性的物质为盐霉素（salinomycin），在发酵液中其质量浓度约为210μg/L。

李豆南等[15]采用顶空固相微萃取（headspace solid phasemicroextractions，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gaschromatgraphymassspectrometrometry，GC-MS）联用技术，对从酱香大曲中分离得到的一株耐热性良好的放线菌FBKL4.010的次生代谢产物进行研究，结果表明，该菌株能代谢产生大量四甲基吡嗪，其含量占总挥发性成分的43.318%，四甲基吡嗪被研究证明为酱香风味的主体成分[42-44]。

罗小叶等[27]对从酱香大曲中分离得到的3株放线菌进行固态发酵，并通过顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，对其挥发性成分组成及成分风味进行了测定。结果表明，3株菌固态发酵挥发性成分以酯类物质为主，分别占62.80%、59.23%、46.77%，且均能产生吡嗪类物质，此外还能产生少量酮类、醛类、酚类等物质。

张建敏[41]采用顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，对从酱香型白酒酿造过程中筛选到的一株产异味突出放线菌株的次生代谢产物的研究表明，该菌种代谢所产土臭素是发酵醅中异味的主要来源，为关键特征性成分；同时，该菌还能抑制产酱香功能解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）产吡嗪类总量，对吡嗪代谢具有一定的调节作用。盐霉素对酿造环境中芽孢杆菌等功能细菌和致病性杂菌具有明显抑制作用，可抑制有害杂菌生长、调控酱香风味形成[45]。同时，尤小龙等[46]通过研究从酱香型白酒酒醅中分离出的2株放线菌的次生代谢产物生物学活性，发现2株放线菌均能代谢产生一种非蛋白类和非肽类抗生素来抑制产酱香的芽孢杆菌生长代谢，从而影响白酒风味物质形成和积累。

2.2 放线菌代谢产酶活性研究

酱香型白酒生产中所需酶类主要为蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等，蛋白酶类使蛋白质降解成氨基酸，促进微生物生长代谢；淀粉酶类水解淀粉成单糖，有利于微生物生长代谢和酒精生成；脂肪酶的水解产物经酯化反应可产一些白酒风味物质；纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解原料中纤维素、半纤维素和果胶等物质，促进淀粉降解[47-49]。近年来，通过对放线菌产酶活性研究表明，其虽没有腐生葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和阿姆斯特丹散囊菌等其他细菌、真菌所产的酶活力高[4-5，15，18]，但也具有较高的酶活力，且由于放线菌是原核生物，结构简单，易于基因改造和遗传分析，在生产开发上还是有一定前景的。

高亦豹[21]研究发现高温放线菌属菌株Thermoactinomyces sanguinis能产多种酶并分解大分子物质，为微生物生长和风味物质合成提供前体物质。王芙蓉[24]从茅台酱香型白酒酒厂的高温大曲中筛选得到4株高温放线菌，通过平板初筛和三角瓶复筛的方法，结果为普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）产淀粉酶活力较高，其淀粉酶活力为815.54U/g干曲；未培养的高温放线菌（uncultured Thermoactinomyces sp.）产纤维素酶的酶活力较高，其酶活力为87.13U/g干曲；糖高温放线菌属菌株Thermoactinomyces sacchari的产蛋白酶的活力最高，其酶活力为1 435.12U/g干曲。罗小叶等[27]对从酱香大曲中分离得到的3株放线菌进行产酶活性研究，结果表明3株菌产果胶酶能力较为突出，酶活分别为299.66U/g、216.52U/g、294.86U/g，部分高于细菌所产果胶酶最高酶活（259U/g）和霉菌所产果胶酶最高酶活（260U/g）；但3株菌产糖化酶、脂肪酶和纤维素酶等其他酶类的酶活相对较低。白成松等[31]从酱香型酒糟中筛选出一株耐高温放线菌株，经鉴定为产色高温单孢菌（Thermomonospora chromogena）。该菌株在55℃对淀粉、纤维素、蛋白质都具有较高的降解能力。于华等[50]从酱香型大曲中成功分离鉴定了一株高产蛋白酶的娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei），通过正交试验，获得该株菌最优产酶条件为培养温度35℃，转速180 r/min，培养基初始pH值为9。此最佳条件下其蛋白酶活力为28.62U/m L。

3 展望

目前，酱香型白酒酿造过程中放线菌的研究在分离鉴定、生物学功能对酒体品质和酱香风味形成等方面取得了一定成果，但相较于浓香型白酒中放线菌的研究还不够全面及深入，很多机制问题还未解决。今后对酱香型白酒酿造中放线菌研究可从以下四个方面进行探索：

根据酱香型白酒生产工艺特点，建立快速有效的样品采集及保存方法是酱香型白酒酿造中，对放线菌等微生物进行研究的基本要求。同时，经过酱香型白酒高温制曲和高温堆积工艺驯化，大量耐高温放线菌株得以发现。准确、高效的样品采集和保存方法的建立也有利于筛选功能型高温放线菌，丰富已知酱香型白酒中放线菌的多样性，为深入的功能性研究提供来源菌株。

第二，酱香型白酒生产地域性要求专一，地理气候环境是决定酒品的关键因素之一，发酵过程中理化因素及环境条件在实验室条件下较难模拟，限制了研究工作的开展。因地制宜，充分考虑温度、湿度、原料、水源、空气、曲房环境及发酵池环境等因素，开展酱香型白酒发酵条件模拟研究，保证研究结果的客观性和准确性。

第三，传统分离鉴定方法对于放线菌的分离鉴定效果不理想，在前期限制了放线菌的研究，随着16S rDNA基因序列分析技术、聚合酶链式反应-变性梯度电泳技术（PCRDGGE）技术和高通量测序技术在微生物分离鉴定领域的广泛应用，提高了放线菌分离鉴定效率，大量未培养放线菌在酱香型白酒酿造过程中被发现，丰富了放线菌多样性；同时，顶空固态微萃取技术、气相色谱-质谱联用技术和液相色谱-质谱联用技术被应用于放线菌次生代谢产物研究，为酱香型白酒酿造过程中放线菌的功能、活性成分及酱香风味形成分析提供了技术保障。

第四，细菌类群作为酱香型白酒生产中的生香动力来源，目前，对其研究主要集中在芽孢杆菌属，对其中放线菌的研究还处于起步阶段，重视程度不够。随着对放线菌次生代谢产物和功能性酶研究的深入，其对酱香型白酒发酵过程调节和风味物质形成的作用开始引起关注。加强酱香型白酒酿造过程中放线菌的研究，为进一步揭示酱香独特风味形成机制指明了新的方向。