基于GC-MS建立花椒挥发油指纹图谱及在汉源红花椒鉴定中的应用

课净璇 瞿 瑗 黎杉珊 申光辉 罗擎英吴贺君 陈安均 蒲 彪 叶 萌 张志清

(四川农业大学食品学院1，雅安 625014)(四川农业大学林学院2，温江 611130)

在我国，花椒作为常用的香辛料，深受人们的喜爱[1]。花椒含有丰富的挥发油[2-3]，酰胺类和酮类[4]等活性成分[5]。挥发油不仅是花椒风味物质的主要成分，还有抑菌的功效[6]，因此，花椒在医药领域中也有一定的应用价值[7-8]，为食药同源性食物。我国花椒种植面积较大，主要产地集中在西部地区，如四川、甘肃、云南、陕西等[9]。四川省就有较多花椒生产地区，如汉源，种植较多的品种为大红袍，唐代列为贡品，故名“贡椒”。以其粒大油重，色泽丹红、醇麻爽口、芳香浓郁而畅销省内外[10]；金阳种植较多的品种为竹叶花椒，其颗粒硕大，色泽碧绿，香、麻味纯正[11]。陕西凤县主要种植品种为大红袍花椒，以色艳、味浓、粒大，形似双耳闻名遐迩，被称为“凤椒”[12]。甘肃武都主要种植品种为大红袍，具有粒大饱满、麻味醇厚、药效成分多、精油含量高等特点[13]。九叶青花椒最早发现于重庆，该变种具有麻味纯正，果实清香等特点[14]。在山西晋东南地区和河北太行山地区栽培较多的品种为小红椒，又称小红袍[15]。大范围的种植虽然提高了花椒产量，但也造成市面上花椒品种鱼龙混杂，质量参差不齐的现状[16]。花椒与中药材性质相似，其质量受产地气候，土壤等因素影响较大。指纹图谱技术多用于鉴定地道药材[17-18]，因此可采用该技术建立花椒挥发油指纹图谱，作为花椒产地鉴别的依据之一。朱琳[19]将气相色谱-质谱法(GC-MS)技术应用于花椒挥发油成分分析，并建立了花椒挥发油GC-MS指纹图谱，发现青花椒挥发油指纹图谱有20个共有峰，红花椒挥发油指纹图谱有11个共有峰。张翔[20]以22个不同产地花椒样品为原料，建立了花椒挥发油和脂肪酸的GC指纹图谱，并结合聚类分析法，得出花椒样品之间的相似度和产地分类与其挥发油含量之间存在一定关系，即高挥发油含量产地之间的花椒相似度在0.9以上，非高挥发油含量的产地花椒之间的相似度在0.9以下的结论。

四川汉源红花椒是国内公认的优质花椒之一，市场上多出现假冒汉源红花椒，提高售价的情况。因此，本研究拟在建立红花椒和青花椒指纹图谱的基础上，建立汉源红花椒指纹图谱，为汉源红花椒产地鉴别提供依据。

本研究采用水蒸气蒸馏的方法提取花椒挥发油，并建立花椒挥发油GC-MS指纹图谱。分析挥发油化学成分差异，结合聚类分析法和主成分分析法对不同产地的花椒挥发油化学成分进行差异分析和分类，确定花椒挥发油成分与产地之间的关系。在此基础上建立汉源红花椒挥发油GC-MS指纹图谱，建立其特征指纹图谱并确定特征峰，根据其特有成分作为汉源红花椒产地鉴别的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料为产自我国西部主要花椒产地的17个花椒样品，包含11个花椒样品(以下按俗称红花椒描述)(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)和6个竹叶花椒样品(以下按俗称青花椒描述)(ZanthoxylumarmatumDC.)，以及产自汉源地区的21个花椒样品(简称汉源红花椒)。样品具体产地见表1，于2016年8—10月收集。

无水乙醚、无水硫酸钠为分析纯：成都市科龙化工试剂厂。

表1 17个实验材料名称及来源

注：Z1～Z11为红花椒样品；Z12～Z17为青花椒样品；H1～H21为汉源红花椒样品。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A-575C气相色谱-质谱联用仪；FW-100高速万能粉碎；SartoriusCP225D型电子天平；98-1-B型电子调温电热套。

1.3 方法

1.3.1 花椒挥发油提取

采用水蒸气蒸馏法提取花椒挥发油。具体操作如下：花椒样品粉碎后过60 目筛。称取粉末10.000 g于1 L的圆底烧瓶中，加入400 mL蒸馏水，再加入3～4粒玻璃珠，并连接蒸馏装置。打开电热套开关进行加热，溶液沸腾后，调节电热套功率，控制油滴以较慢的速度从冷凝管滴下，持续回流4 h。提取完成后，关闭电热套电源，待装置冷却至室温时，读出挥发油体积数(mL)。收集得到的挥发油用适量无水乙醚溶解，并加入无水硫酸钠于-20 ℃下保存过夜。进样前用0.22 μm的滤头过滤，即得到供试样品溶液[21]。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱；程序升温：初始柱温为50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至100 ℃，保持3 min，最后以3 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；载气为高纯He；进样口温度250 ℃，检测器温度260 ℃，进样量为2 μL，分流比为40∶1，溶剂延迟时间3 min。

1.3.3 质谱条件

EI离子源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描范围m/z40 ～ 550 amu，NIST 11.1标准谱库检索。在相同实验条件下检测所有样品，记录样品GC-MS总离子流图。

1.4 数据分析方法

1.4.1 不同产地花椒挥发油含量差异分析

花椒挥发油含量(mL/100 g)=挥发油体积(mL)/花椒粉末的质量(g)×100

(1)

根据式(1)计算样品中挥发油含量，并分别计算红花椒和青花椒挥发油含量平均值。

1.4.2 不同产地花椒挥发油成分差异分析

在相同条件下依次测定38个样品供试样液，记录色图谱。通过GC-MS系统自带的NIST 11.1标准谱库检索对花椒样品色谱图进行定性分析，鉴定花椒挥发油的化学成分。并采用峰面积归一法确定其相对质量分数。

1.4.3 不同产地花椒挥发油聚类分析

系统聚类分析可根据样品之间的亲疏远近关系将样品分类，样品相似度越大，两者之间的距离越近。较适合样品数量较少时的聚类分析，最终输出树状图的聚类结果[22]。根据本实验所得花椒挥发油总离子流图，经过化学成分差异分析，分析不同产地红花椒和青花椒样品挥发油的共有峰，并将共有峰峰面积作为花椒挥发油聚类分析的分析对象，将数据导入SPSS 22.0软件，采用组间连接法，并用欧氏距离的平方(Squared Euclidean Distance)为测度对其进行聚类分析。

1.4.4 不同产地花椒挥发油主成分分析

主成分分析是一种降维的数据分析方法，根据样品之间的相似度将样品分成若干组[23]。本实验将红花椒和青花椒挥发油共有峰峰面积导入SPSS 22.0软件，对不同产地花椒样品挥发油化学成分进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度

取同1份供试品溶液，在1.3.2中同一色谱条件下，连续进样6次，进样量2 μL，记录色谱图。以芳樟醇为参照峰(S)，计算其他峰保留时间RSD值小于0.93%，峰面积RSD值小于0.83%。

2.1.2 稳定性

取同1份供试品溶液，在1.3.2中同一色谱条件下，于放置 0、2、4、8、12、24 h后分别进样，进样量2 μL，记录色谱图。以芳樟醇为参照峰(S)，计算其他峰保留时间RSD值小于0.98%，峰面积RSD值小于0.90%。

2.1.3 重现性

取6份同一样品适量，按照1.3.1中供试品溶液的制备方法制备，在1.3.2中同一色谱条件下，进样量2 μL，记录色谱图。以芳樟醇为参照峰(S)，计算其他峰保留时间RSD值小于0.94%，峰面积RSD值小于0.89%。

精密度，稳定性和重现性实验中各共有峰保留时间的RSD值小于0.98%，峰面积的RSD值小于0.90%，均小于3%，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)中的规定[24]。

2.2 不同产地花椒挥发油含量差异分析

挥发油是花椒香气成分的主要成分，花椒挥发油含量的多少可直接反映花椒的香气强度[25]。在GB/T 30391—2013中，将花椒挥发油含量是作为反映花椒香气的理化指标之一[26]。所以，花椒挥发油含量是反映花椒风味物质含量的一项重要指标。通过该指标的测定，结果显示：红花椒挥发油含量范围为5.12～8.34 mL/100 g；青花椒挥发油含量范围为9.52～11.51 mL/100 g。红花椒和青花椒挥发油含量的平均值分别为6.86 mL/100 g和10.57 mL/100 g。青花椒挥发油平均含量是红花椒的1.45倍，显著性分析结果显示两者之间存在极显著差异(P<0.01)。不同产地花椒挥发油含量结果如表2所示。红花椒中挥发油含量最多的是越西贡椒，含量最少的是韩城大红袍。青花椒中挥发油含量最多的是武都青花椒，含量最少的是金阳青花椒。

表2 不同产地花椒挥发油含量的分析结果

注：Z1～Z11：我国西部地区红花椒样品；Z12～Z17：我国西部地区青花椒样品；H1～H21：汉源红花椒样品。

2.3 不同产地花椒样品挥发油成分差异分析结果

在相同实验条件下依次测定样品供试液，记录花椒挥发油GC-MS总离子流图，如图1所示。采用NIST 11.1标准谱库检索对花椒挥发油色谱图进行定性分析，结合峰面积归一法计算各组分相对质量分数，统计匹配度大于95%且相对质量分数大于0.1%的组分。表3～表5分别为红花椒、青花椒和汉源红花椒挥发油中主要化学成分(平均相对质量分数大于1%)。

图1 不同挥发油总离子流图

编号RTCAS中文名称分子式相对含量/%123456789101119.259000555-10-2异松油烯C10H163.7690.9771.0370.3451.4550.1392.5161.0592.6501.9011.330210.008000127-91-3β-蒎烯C10H161.8013.3746.1272.7755.8852.9482.292310.490000099-83-2α-水芹烯C10H161.15411.1280.6370.980411.012029050-33-7长松针烯C10H163.6012.2042.5522.2611.806511.548005989-27-5右旋柠檬烯C10H1622.52711.97818.44937.15141.93238.04628.06014.49616.96118.09814.866611.637000470-82-6桉叶油醇C10H166.3882.7632.3565.2361.2695.0362.0643.0807.2274.0232.836711.995003779-61-1反式-β-罗勒稀C10H164.2080.8641.2842.4372.6113.4203.0151.1863.3811.1931.069812.428003338-55-4水芹烯C10H161.8140.9751.5812.8623.1701.8701.4251.4731.3101.124912.854000099-85-4萜品烯C10H165.8432.9173.6244.1233.8435.8013.6783.3501014.132000586-62-9萜品油烯C10H161.6161.0691.3720.3680.3490.3821.3981.3621.6391.2961.2261114.806000078-70-6芳樟醇C10H18O6.10822.93624.98624.23122.6018.19915.12827.2515.15322.61121.1211218.896000098-55-5alpha-松油醇C10H18O5.9928.4703.4272.7982.9895.0058.5053.7605.8145.5901321.789000144-39-83,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇丙酸酯C13H22O21.30424.95212.3789.5368.2089.27811.09812.1571.38719.10523.1631426.621000080-26-2乙酸松油酯C12H20O23.2213.1891.8611.4590.7450.9502.1765.5052.4122.5611527.549000141-12-8乙酸橙花酯C12H20O21.3791.7960.6530.4840.6590.7581.5801.3581.1461628.594000105-87-3乙酸香叶酯C12H20O22.2013.1371.2270.9171.0381.2832.6730.8392.2551.8971733.103023986-74-5大根香叶烯C15H240.9140.8810.4862.4491.7383.6040.4890.3671.2550.4610.6241835.089000483-76-1d-茄烯C15H241.3290.7360.5961.1230.6141.5190.4370.49732.0550.4370.707

表4 青花椒挥发油成分的 GC-MS分析结果

2.3.1 花椒挥发油成分共有峰确认

GC-MS总离子流图显示，红花椒挥发油共确定出16～34个峰，共有峰有8个，其共有峰面积占总峰面积的62.08%。青花椒挥发油共确定出22～33个峰，共有峰为11个，共有峰面积占总峰面积的84.86%。具体结果见表6。该结果表明，不同产地红花椒挥发油所含化学成分的差异性大于青花椒，即产地对红花椒挥发油化学成分及其含量的影响大于青花椒。对比两者共有峰成分可知，红花椒挥发油共有峰中特有的化学成分有：异松油烯，反式-β-罗勒烯，大根香叶烯和d-茄烯；青花椒挥发油共有峰中特有的化学成分有：α-左旋-蒎烯、长松针烯、萜品烯、侧柏酮、4-萜烯醇、1-石竹烯和丁香烯。故红花椒和青花椒香气存在一定差异。

2.3.2 花椒挥发油成分差异分析

由NIST 11.1标准谱库检索对花椒挥发油色谱图进行定性分析结果可知，红花椒挥发油共确认出39种化学成分。其中，萜烯类有21种，醇类10种，醛类1种，酮类2种，酯类5种。青花椒挥发油总离子流图中共确认出38种化学成分。其中，萜烯类22种，醇类7种，醛类2种，酮类1种，酯类6种。红花椒挥发油和青花椒挥发油所含化学物质的共同之处在于萜烯类，醇类和酯类含量较多，红花椒挥发油萜烯类峰面积占总峰面积的49.74%，醇类峰面积占总峰面积的30.81%，酯类峰面积占总峰面积的19.40%；青花椒挥发油中萜烯类峰面积占总峰面积的19.39%，醇类峰面积占总峰面积的78.60%，酯类峰面积占总峰面积的1.51%。对比该三种物质峰面积占总峰面积的百分比可知，红花椒挥发油含萜烯类物质较多，再次是醇类物质，而青花椒挥发油含醇类物质较多，其次是萜烯类物质。另外，红花椒挥发油酯类峰面积占总峰面积的比例高于青花椒。故红花椒和青花椒之间的香气存在的差异部分原因有可能是由于所含的酯类物质多少的不同引起的。

2.4 聚类分析结果

图2 GC-MS指纹图谱聚类分析结果

系统聚类分析结果如图2所示。结果表明我国西部17个产地的花椒分成两大组，其中红花椒和青花椒分别为一组，说明红花椒挥发油和青花椒挥发油之间存在着较显著的差异。Z12 ～ Z17样品为青花椒，被分为一组(组Ⅰ)，且样品之间的距离较近，表明不同产地青花椒挥发油化学成分相似性较大。我国西部红花椒样品被分为一组，其中根据样品之间的距离又可以将其分为两组(组Ⅱ和组Ⅲ)。组 II包含5个样品，即Z2、Z3、Z8、Z10和Z11。其中Z8和10都是来自甘肃武都的红花椒，两者产地一样，被聚类为同一组。组Ⅲ包含6个样品，即Z1、Z4、Z5、Z6、Z7、Z9。其中Z4产地为四川凉山越西，Z5和Z6的产地为四川汉源，但在地理位置越西与汉源为临近区县，Z5和Z6两个样品在聚类谱系树状图中的距离也最接近。表明其挥发油化学成分相似性较大，故红花椒挥发油成分受产地的影响较大。

2.5 主成分分析结果

将花椒挥发油共有峰峰面积导入SPSS 22.0 软件，取特征值在1.0以上的主成分进行分析。结果表明，特征值在1.0以上的主成分共有3个(PC1、PC2和PC3)。主成分PC1、PC2和PC3在分析模型中的贡献率分别为66.30%、12.97%和8.40%。故

表5 汉源红花椒挥发油成分的 GC-MS分析结果

表5续

可根据这三个主成分即可概括分析不同产地花椒挥发油之间的相似性。根据主成分PC1，PC2和PC3得分绘制三维散点图，如图3所示。17个花椒样品被分为4组，其中组Ⅰ包含Z2、Z7、Z8、Z10和Z11。这五个样品在PC1、PC2和PC3的得分都是负值。与聚类分析结果相似，Z8和Z10也被分到同一组。组Ⅱ包含Z1、Z3和Z9，这三个样品在PC1和PC2的得分都是负值，在PC3的得分为正值。与聚类分析结果一致，组Ⅲ包含Z4、Z5和Z6，这三个样品在PC1得分为负值，PC2得分为正值，PC3得分在0附近。组Ⅳ包含所有的青花椒样品，在PC1和PC2得分都是正值，在PC3上得分在0附近。所检测的青花椒被分为同一组，分布较为集中，说明青花椒挥发油之间的差异受产地的影响较小，红花椒挥发油之间的差异受产地的影响较大，该结论与本研究聚类分析实验结论一致。

图3 GC-MS指纹图谱主成分分析结果

2.6 GC-MS指纹图谱技术在汉源花椒产地鉴定中的应用

2.6.1 汉源红花椒挥发油含量分析

由表2可知，汉源花椒挥发油含量在4.56～9.57 mL/100 g之间，平均含量为7.34 mL/100 g，高于我国西部地区各产地红花椒挥发油含量的平均值(6.86 mL/100 g)。汉源花椒挥发油含量在4.46～6.86 mL/100 g之间的样品有8个，其余13个样品(61.90%)挥发油含量均高于6.86 mL/100 g，即超过一半的汉源花椒样品挥发油含量高于我国西部地区各产地红花椒挥发油含量的平均值。表明汉源红花椒挥发油整体含量较高。

2.6.2 汉源红花椒样品挥发油成分特征性分析

汉源红花椒挥发油总离子流图共确定出16 ～ 35个峰，共有峰有11个，共有峰面积占总峰面积的78.69%。汉源红花椒共有峰和我国西部地区红花椒相比，共有峰个数多出2个，共有峰面积占总峰面积比例高出16.61%，即汉源红花椒挥发油化学成分较一致。其挥发油共确认出39种化学成分，萜烯类20种，其峰面积占总峰面积的62.64%；醇类11种，其峰面积占总峰面积的23.28%；酯类6种，其峰面积占总峰面积的13.49%。酮类1种，其峰面积占总峰面积的0.24%；酸类1种，其峰面积占总峰面积的0.19%。汉源红花椒共有峰特征物质与我国西部地区红花椒共有峰特征物质之间对比情况如表6所示。由表6结果可知，汉源红花椒共有峰中特有的化学成分有5种，即崖柏烯、乙酸松油酯、乙酸橙花酯、乙酸香叶酯和1-石竹烯，故该5种成分可作为汉源红花椒挥发油的特征成分，作为汉源红花椒产地鉴定的依据之一。

表6 我国西部地区红花椒、青花椒和汉源红花椒共有峰特征物质之间的对比结果

3 讨论

挥发油是花椒风味物质的主要成分之一，是生产花椒精油时首要检测的重要经济价值指标。本实验采用GC-MS技术，测定花椒挥发油总离子流图，建立红花椒和青花椒挥发油GC-MS指纹图谱，并对其进行差异分析。结果表明青花椒挥发油含量与红花椒挥发油含量之间存在极显著差异，该结论与朱琳研究结果一致[19]。

两种花椒挥发油鉴定出的化学成分种类基本一致，通过对红花椒和青花椒挥发油指纹图谱差异分析，发现青花椒挥发油共有峰数多于红花椒，且青花椒共有峰面积占总峰面积的84.86%高于红花椒(62.08%)。结果表明，不同产地青花椒挥发油化学成分较一致，不同产地红花椒挥发油成分差异较大，该结论与罗凯等[27]采用同时蒸馏萃取法提取不同地红花椒和青花椒挥发油，采用气质联用的方法测定挥发油成分，得出青花椒挥发油成分共有成分占总峰面积百分比大于红花椒的结论一致。根据两种花椒挥发油成分对比结果可知，青花椒和红花椒挥发油主要成分都为萜烯类、醇类。该结论与杨静等[28]的研究结果一致。但红花椒挥发油中含萜烯类物质较多，青花椒挥发油含醇类物质较多。对比具体化学成分可知，红花椒挥发油所含柠檬烯较多，占总峰面积的23.87%，是青花椒挥发油(13.22%)的1.8倍。青花椒挥发油含芳樟醇较多，占总峰面积的64.77%，是红花椒挥发油的(19.12%)3.39倍。该结论与石雪萍等[29]采用水蒸气蒸馏法提取红花椒和青花椒挥发油并测定其主要成分，得出青花椒和红花椒主要成分为醇类物质和烯类物质，且青花椒芳樟醇含量是红花椒的3倍的结论一致。柠檬烯和芳樟醇是花椒挥发油主要化学成分，其含量多少会影响花椒风味[30]，所以，青花椒和红花椒之间的香气差异可能是由于柠檬烯和芳樟醇含量的不同引起的。

红花椒挥发油非共有峰占总峰面积的37.92%，所占比例较高，所以红花椒挥发油非共有物质可作为产地鉴定的依据。根据聚类分析和主成分分析结果可知，不同产地青花椒样品被分为一组，样品之间的相似性较大。而红花椒被分为2～3组，所以红花椒挥发油所含化学成分受产地的影响较大。该结论与陈光静等[21]采用GC-MS技术分析不同产地红花椒挥发油成分差异，得出样品间香气的品质的差异受挥发油含量和组分差异有关，并可将该两种指标作为红花椒产地鉴别的依据之一的结论一致。因此可以根据红花椒挥发油中某种特有成分作为该产地红花椒鉴别的依据。由表6可得知，汉源红花椒挥发油特有成分有5种，该5种物质可以作为汉源花椒产地鉴定的指标之一。且汉源花椒含有独特的乙酸松油酯，乙酸橙花酯和乙酸香叶酯，这三种物质在挥发油中的含量虽然不是最多的，但是对汉源红花椒优质的香气具有一定的贡献作用。即本实验探索出了汉源红花椒挥发油中的特有物质，可作为其产地鉴定时的依据之一。由于本实验只以当季花椒为实验材料，测定其挥发油成分，未涉及非当季花椒，所以本实验结果只适用于当季花椒的鉴定。非当季花椒挥发油成分与产地之间的差异尚待研究。

4 结论

本实验采用水蒸气蒸馏的方法提取花椒挥发油，发现青花椒挥发油含量是红花椒挥发油的1.45倍，两者之间存在极显著差异。采用GC-MS技术，建立我国西部地区红花椒和青花椒挥发油指纹图谱。根据化学成分差异分析结果结合聚类分析法和主成分分析法结果，表明不同产地青花椒挥发油之间相似性较大，不同产地红花椒挥发油化学成分差异较大，可以将红花椒挥发油非共有组分作为花椒产地鉴别的依据。根据本实验的方法建立汉源红花椒挥发油指纹图谱。经分析，崖柏烯、乙酸松油酯、乙酸橙花酯、乙酸香叶酯和1-石竹烯5种物质可作为汉源红花椒产地鉴定的依据。