钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达与瓣膜性房颤发生的关系

瓣膜性房颤主要是由于心腔扩大、心脏瓣膜狭窄等一系列心脏形态学变化及心血管压力改变引起的心脏瓣膜病，易继发性引起瓣膜性房颤，多发于老年人，其危险程度较高，严重影响人们的生活水平和生命健康问题，随着我国老龄化进程的加快，此类疾病亟须寻求更科学的治疗方案。钙调神经磷酸酶(CaN)Ca2+/钙调蛋白依赖酶广泛分布于身体各个组织，参与多个信号系统调节人体的各种生物学反应。近期有学者发现CaN-NFAT通路在维持心脏正常形态尤其是心脏瓣膜与心隔的形成过程中起着至关重要的作用[1]。钙蛋白酶-2参与多种底物的催化过程。钙蛋白酶-2常见于在心房肌细胞表达，心内膜和心外膜未见表达[2-3]。激活钙蛋白酶-1所需的Ca2+浓度为微摩尔级，而激活钙蛋白酶-2所需的Ca2+浓度为毫摩尔级[4]。正常生理情况中Ca2+浓度较低仅能激活钙蛋白酶-1，这意味着在病理情况下才会激活钙蛋白酶-2，进而引起疾病的发生与发展[5]。本研究分析心脏瓣膜病病人心肌组织中钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达水平与瓣膜性房颤发生的关系，以推测瓣膜性房颤的发病机制，并寻求新的治疗方向。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年6月—2016年4月在我院因心脏瓣膜病住院接受瓣膜置换手术的病人78例，诊断根据2016年中华医学会心血管病学会制定的标准，对病人可能干扰试验因素进行排查，并对内部构成因素进行标准化比较，筛选出符合条件受试者48例。男26例，女22例；年龄37岁～72岁(56岁±7岁)。根据心电图结果分为窦性心律组(22例)和房颤组(26例)，搜集临床资料，病人均已知情并签订知情同意书。排除标准：极速性心房颤动(心率>180次/min)、由神经因素引起的非瓣膜性心房纤颤、先天性心脏瓣膜病病人。

1.2 检测仪器 美国惠普8500型彩色多普勒超声诊断仪(HP8500)；美国SH38-iS ITAT血气分析仪；美国Biofuge Stratos离心机、美国多功能酶标仪SPECTRA max M2、转移电泳槽、聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直电泳槽、日本富士化学发光成像分析仪LAS-4000、德国KMO2基本型磁力搅拌器、漩涡振荡器、脱色摇床、冰箱。

1.3 检测试剂及材料 鼠抗人CaN单克隆抗体、兔抗人钙蛋白酶-2多克隆抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体、Western -抗稀释液、ELC发光试剂盒、RIPA裂解液、蛋白质提取试剂盒、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、SDS-PAGE上样缓冲液、预染蛋白Marker、30%聚丙烯酰胺、三-羟甲基-氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、EP管、移液枪等生化试验器材。

1.4 检测方法 两组均在心脏病瓣膜置换手术建立体外循环心脏停跳前，切取右心耳心肌组织并迅速放入液氮中，转移至冰箱中以-80 ℃进行保存，获取标本。

一般资料：性别、年龄、身高、体重、视诊有无二尖瓣面容、吸烟史、饮酒史、血压、心率、血红蛋白含量及内科用药情况(地高辛、利尿药、β受体阻断药及其他内科用药)。心脏形态学指标：左房内径、左室内径、右室内径、室间隔厚度、左室后壁厚度、心胸比例、二尖瓣瓣口面积。 血气指标：左心室射血分数(LVEF)。蛋白质表达情况：采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达水平。 蛋白酶-2、CaN蛋白表达水平：采用Western Blot法检测，步骤依次为：总蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE凝胶的配置、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、一抗结合、洗膜、二抗结合、化学发光法检测蛋白表达情况。最终得到Western Blot蛋白显影图像。

2 结 果

2.1 两组临床资料及用药情况比较 两组年龄、性别、体重指数(BMI)、吸烟、饮酒、血压及血红蛋白含量指标差异无统计学意义(P>0.05)；但房颤组心率较窦性心律组明显偏高，查病人是否存在二尖瓣面容，房颤组数据明显高于窦性心律组，差异具有统计学意义(P<0.05)；比较两组用药情况，房颤组服用地高辛的比例明显高于窦性心律组，差异具有统计学意义(P<0.05)，比较两组服用利尿剂、β受体阻断药及其他药物的使用情况差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 窦性心律组和房颤组临床资料比较

2.2 两组心胸比例、二尖瓣瓣口面积比较 房颤组心胸比例高于窦性心律组，差异具有统计学意义(P<0.05)；房颤组二尖瓣瓣口面积较窦性心律组明显缩小，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

2.3 两组超声心动图检查结果 窦性心律组左室射血分数值明显高于房颤组，差异具有统计学意义(P<0.05)；超声检查房颤组左房内径较窦性心律组明显增大，差异具有统计学意义(P<0.05)；但检查两组左室内径、右室内径、室间隔厚度及左室后壁厚度时两组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表2 窦性心律组与房颤组心胸比例、二尖瓣瓣口面积比较(±s)

表3 窦性心律组与房颤组病人超声心动图指标的比较(±s)

2.4 两组心肌组织钙蛋白酶-2、CaN表达情况 房颤组心肌组织中钙蛋白酶-2表达水平为(0.85±0.38)，高于窦性心律组的(0.48±0.21)，差异具有统计学意义(P<0.05)；比较两组钙调神经磷酸酶蛋白表达水平，房颤组为(1.25±0.47)，明显高于窦性心律组的(0.81±0.32)，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

瓣膜性心脏病是一种常见于老年人的疾病，由于心脏瓣膜关闭不全常继发性引起心房纤颤，随着社会环境的改变，瓣膜性心脏病的发病年龄趋于年轻化，发病率增高，心血管压力的升高、蛋白因子表达的变化引起的心腔室扩大、形态改变以及心脏瓣膜面积的改变是此病发生的中心环节。

钙调神经磷酸酶是一种依赖Ca2+激活的信号酶，其在身体各个组织中均有表达，并参与调节多种细胞的信号交流、功能作用。钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子信号通路具有维持心血管系统正常的生理、形态功能的作用，并且对心血管病理生理过程具有一定的调节作用。在心血管形态发生、心脏瓣膜形成、血管内皮细胞发育、冠状血管以及成熟心脏纤维基质的形成等心血管发育过程中均存在此信号的调节[5-8]。在心脏胚胎发育时期CaN-NFAT通路在最终发育为心脏瓣膜的心肌组织中呈高水平表达，表明其在心脏的组织胚胎学发育中的心脏瓣膜与心隔的形成中具有重要作用。当心内膜垫内膜细胞即将从心内膜层分离并转分化为间叶样细胞时，心脏瓣膜开始形成[9]。NFAT蛋白通常与多嘌呤核苷酸序列相(A/T)GGAAAA结合，增强细胞因子转录子和增强子的活性以促进心内膜细胞的增生[10]。NFAT还参与介导心脏心内膜VEGF信号传导通路，参与心内膜垫的形成。在胚胎初期，NFAT具有调节血管平滑肌与血管内皮细胞生成的作用，血管内皮生长因子(VEGF)作用于内皮细胞后，NFATcl进入细胞核内，与环氧化酶-2(COX-2)启动子上的特定位点相结合，从而激活COX-2的转录，而COX-2是前列腺素合成的关键酶，其在血管内皮的迁移和血管形成过程中是一种必不可少的物质[11]。 钙蛋白酶-2在心房纤颤病人的心肌组织中呈高水平表达，又由于钙调神经磷酸酶是其催化底物，由此推断钙蛋白酶-2可通过调节CaN活性以调控参与CaN-NFAT通路，继而导致瓣膜性房颤的发生。

本研究中，房颤组病人心肌组织的钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶水平均明显高于窦性心律组，房颤组的心脏形态结构以及心脏瓣膜面积均发生病理性的改变，这个结果也印证了钙调神经磷酸酶参与的CaN-NFAT通路通过影响心脏心肌组织及心脏瓣膜的正常形态学结构，进而引发瓣膜关闭不全引起心房纤颤。

心肌组织中钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白的表达影响了心肌组织正常的形态结构，改变了心脏瓣膜的面积，引发了瓣膜性心房纤颤。