颐脑解郁方对抑郁大鼠PI-3K/Akt信号转导通路的影响

，瑞珍，子珺，

抑郁症是指以情绪低落、兴趣减退以及思维迟滞等为主要特征的精神情感类疾病，具有发病率高、复发率以及自杀率高等特点[1]。此病给病人家庭以及社会带来了诸多负担和经济损失[2]。目前抑郁症的发病机制及治疗靶点并不十分明确，信号转导通路的研究有利于进一步深化对抑郁症发病机制的认识。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI-3K/Akt)信号转导通路是由PI-3K和Akt组成的一条重要的抗细胞凋亡/促增殖信号转导途径。蛋白激酶 B(protein kinase，PKB/Akt)作为PI-3K主要下游效应分子，磷酸化后可从胞膜脱离，进入胞浆或胞核内，进而参与多种生物效应，与抑郁症发生有关[3]。现阶段抑郁症的西医治疗效果不佳，而中医学在治疗抑郁症状以及改善西药副作用方面疗效显著。益肾调气中药颐脑解郁方无论是基础研究还是临床治疗抑郁障碍均收效满意[4-6]。本研究拟通过孤养结合慢性不可预知性温和刺激(CUMS)建立抑郁动物模型，采用中药颐脑解郁方进行干预，观察抑郁大鼠脑内PI-3K、Akt表达的变化，旨在探讨益肾调气中药颐脑解郁方对抑郁大鼠的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性Wistar大鼠32只，6月龄，体质量(210±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证：SCXK(京)2016-0006。大鼠适应性预养1周，自由摄食和饮水，动物房室温(23±1)℃，相对湿度60%～70%，光照周期昼夜各12 h(07：00～19：00光照；19：00至第2天07：00黑暗)，室内安静。

1.2 药物 中药颐脑解郁方，方药组成：刺五加、栀子、五味子等，购于北京中医药大学第三附属医院中药房，配方颗粒北京康仁堂药业有限公司生产。西药盐酸氟西汀[礼来(苏州)制药有限公司]。灌胃剂量按照成人常用量20mg/(60 kg·d)的7倍计算大鼠用量0.233 mg/(100 g·d)，大鼠灌胃前先将中药溶于蒸馏水，混匀，浓度为0.233 mg/mL。按照灌胃剂量溶解药物，浓度每1 mL含生药0.62 g，4 ℃冰箱冷藏备用，使用前加热。

1.3 主要试剂及仪器 戊巴比妥钠(美国Sigma公司产品，货号BW0336)，β-actin(国产)，三羟甲基氨基甲烷(Tris，日本)，乙二胺四乙酸(ED-TA)，苯甲基磺酰氟(PMSF，美国Sigma公司)，去氧胆酸钠(美国Sigma公司)，考马斯亮蓝(美国Sigma公司，G-250)，溴酚蓝指示剂(Bromophenol Blue，美国Sigma公司)，丙烯酰胺(国产)，甲叉双丙烯酰胺(国产)，HRP标记的二抗(国产)，显色试剂(ECL Prime Western Biotting Det，货号RPN2232)，硝酸纤维素膜(NC膜)，显影粉(XYF002)，定影粉(DYF001)，十二烷基硫酸钠(SDS)，蛋白Maker，PI-3K一抗(CST，美国)，Akt一抗(CST，美国)，电子天平(珠恒电子有限公司，型号JCS-11002A)。自制大鼠束缚架，自制大鼠夹尾夹，自制冰水游泳实验水箱，水浴锅，组织匀浆器，超声装置，紫外可见分光光度计(HP-960型美国)，低温离心机(Beckman日本)，电泳仪(BIO-RAD，美国)，湿转仪(BIO-RAD，美国)，酸度计(HI9321HANNA，Italy)，脱色摇床(TS-1型，江苏)，层析冷柜(YC-1北京)，Fluorchem图像分析系统(美国)。

1.4 模型制备 抑郁模型采用孤养联合21 d慢性不可预知性温和刺激建立抑郁模型[7-8]。即单笼饲养进行为期3周的应激实验，随机选取7种应激方法，包括禁食24 h、禁水24 h、潮湿垫料24 h、夹尾1 min、鼠笼倾斜45° 24 h、4 ℃冰水游泳5 min、束缚3 h这7种方法，每天严格按照表格方案应用其中一种刺激方法，每种方法使用3次。详见表1。

表1 抑郁大鼠21 d抑郁造模方法安排表

1.5 分组及给药 购入大鼠适应性预养1周后，采用旷场实验(open field test，OFT)进行行为学评分，选择评分相近的大鼠，随机分为正常组、模型组、中药治疗组及西药治疗组，每组8只大鼠。正常组不予干预，常规饲养，其余组于应激结束后药物干预6周。中药组灌胃中药颐脑解郁方，西药组灌胃盐酸氟西汀，模型组灌胃蒸馏水，根据体质量变化每周调整灌胃量，连续灌胃42 d。取材前1 d禁食不禁水24 h，各组取8只大鼠， 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，断头取脑，冰盘上快速分离右侧前额叶皮质及海马，微量称称取80 mg，迅速放入标记好分组的EP管并暂时液氮速冻，待取材结束后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.6 Western-blot检测 取出冻存前皮质及海马，分别加入组织裂解液，电动匀浆，离心，变性处理，制成蛋白质样品，以紫外线分光光度计测量蛋白质浓度，调节蛋白质浓度后进行免疫印迹检测。步骤如下：经过灌胶、加样、电泳、转膜后，将膜装入5%脱脂奶粉封闭液，制置室温摇床上持续摇动2 h；加一抗(Akt 1∶800；PI 3K 1∶500)，于4 ℃冰箱过夜；然后加入浓度为1∶2 000偶联有辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG，置室温下摇床上持续摇动2 h；最后显色(ECL化学发光试剂盒)，曝光，显影，定影。采用Fluorchem图像分析系统测定蛋白带的光密度，进行半定量分析。

2 结 果

2.1 抑郁大鼠脑内Akt的表达 经Western-blot蛋白印迹方法测定显影后，获得β-actin条带和分子量为60 kD的深色条带。详见图1。模型组大鼠前额叶皮质层Akt表达与正常组相比明显升高，有统计学意义(P<0.01)，海马Akt表达与正常相比升高，差异有统计学意义(P<0.05)；经药物干预后，中药治疗组及西药治疗组大鼠海马及皮质层Att表达下降，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

1为正常组；2为模型组；3为中药治疗组；4为西药对照组图1 各组大鼠皮质及海马Akt表达

表2 各组大鼠海马及皮质层Akt表达相对量比较(±s)

2.2 抑郁大鼠脑内PI-3K的表达 经Western-blot蛋白印迹方法测定显影后，获得分子量为85 kD的目的蛋白。详见图2。模型组海马及皮质内的PI-3K表达明显升高，与正常组相比差异有统计学意义(P<0.05)；经药物治疗后，中药治疗组和西药治疗组大鼠海马、皮质PI-3K表达下降，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

1为正常组；2为模型组；3为中药治疗组；4为西药治疗组图2 各组大鼠脑内PI-3K表达

表3 各组大鼠海马及皮质内Akt表达相对量比较(±s)

3 讨 论

PI-3K/Akt信号转导通路是蛋白激酶偶联受体介导的一条重要抗凋亡/促增殖信号转导途径。其中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3K或PI-3K)是该通路的中心环节，其配体与受体结合后，PI-3K通过其p85亚单位与活化的受体结合，使其p110亚单位被受体磷酸化而活化[9]。另PI-3K可催化PIP3产生，并通过结合蛋白激酶B(PKB，为原癌基因C-akt的产物，又称为Akt)的PH结构域，将其锚定于质膜而活化。Akt作为该通路上的另一重要效应分子，是 PI-3K 的主要下游靶目标，可磷酸化多种蛋白，而从介导细胞代谢以及存活等效应[10-11]。研究表明PI-3K信号通路与抑郁症密切相关[12- 13]，不仅可以通过下游的内皮型-氧化氮合酶(eNOS)/NO/血管内皮生长因子(VEGF)途径调节血管舒缩功能，调节脑血流量，改善学习记忆能力，还可以被激活，促进关键蛋白PI-3K及Akt的磷酸化上调释放神经营养因子(BDNF)来抵抗神经元损伤，促进神经细胞的修复与再生[3， 14]。Martin等[15]研究表明，抑郁不仅伴随炎症，还伴有多种氧化应激途径的诱导。神经炎症反应是抑郁症神经血管单元失稳态的重要病理环节。中药靶向神经炎症反应补肾以固其本，提高神经血管单元自稳调节能力，防止炎症因子及代谢物之积聚，以通络解郁[16]。另有神经营养假说认为 PI-3K/Akt信号转导通路异常导致的BDNF分泌的减少是抑郁症发生的关键环节之一[17]。应激是引起细胞信号转导异常的重要原因之一，本研究采用21 d慢性不可预知性温和刺激建立抑郁大鼠模型脑内表现为信号转导分子PI-3K及下游重要效应分子Akt表达的升高，可能与氧化应激、血管内皮生长因子以及BDNF减少等多种因素引起的神经元细胞凋亡有关，海马以及皮质神经元受损而功能缺失，进而大鼠表现出记忆减退及情绪障碍。

本研究发现抑郁模型大鼠脑海马及前额叶皮质存在PI-3K及Akt表达的升高，采用益肾调气中药颐脑解郁方进行干预后，大鼠脑内PI-3K及Akt表达下降，细胞信号转导分子是重要的药物作用靶位，益肾调气中药颐脑解郁方的抗抑郁作用可能与下调PI-3K/Akt信号转导通路，降低PI-3K、Akt的表达，阻止神经细胞凋亡，减少神经元受损有关。