芪参益气滴丸对心肌缺血再灌注大鼠炎症反应和细胞凋亡的影响

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心肌缺血再灌注诱导的损伤是急性心肌梗死溶栓和介入治疗中经常伴随的一种病理损伤[1-2]。芪参益气滴丸对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。据研究显示，芪参益气滴丸可增加缺血心脏组织的能量代谢物质三磷酸腺苷(ATP)的含量，从而改善脑缺血后发生的能量代谢障碍[3]。芪参益气滴丸可以减少心肌细胞凋亡，抑制炎症反应发生，间接保护心肌缺血再灌注损伤。本研究通过建立心肌缺血再灌注损伤模型，研究芪参益气滴丸对心肌缺血再灌注大鼠炎症反应和细胞凋亡的保护作用，以期为进一步深入研究提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料 选取雄性大鼠120只，体质量为(199.2±23.2)g，购于本直属大学实验动物中心。DMEM培养液、胎牛血清、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白及酶基质胶与Mdivi-1(美国Sigma公司)；白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(上海玉博生物科技有限公司提供)；芪参益气滴丸购于天士力制药集团股份有限公司(国药准字Z200330139，规格为5 g，用于试验组的使用)。

1.2 实验方法

1.2.1 内皮细胞的培养和鉴定[4]选取培育成熟的雄性大鼠进行内皮细胞培养试验。首先采用腹腔注射的方式将3 g/L戊巴比妥钠进行注射麻醉后，于无菌条件下取出试验大鼠的左心室，注意将其放于磷酸盐缓冲溶液(PBS)试管中，冲洗干净；然后剪碎心肌组织，加入75%乙醇灭活30 s，加入等体积的2.5 g/L的Ⅱ型胶原酶后，37 ℃水浴中消化反应5 min。结束后加入等体积2.0 g/L胰蛋白酶进行反应，相同温度条件下消化反应10 min，然后加入等体积含有20%胎牛血清的DMEM培养液进行中和反应，将此反应终止。静置，离心，弃上清液，将细胞重新完全悬在培养液中，在培养皿上进行接种，37 ℃温度，2%二氧化碳孵化箱中恒温培养6 h。收集细胞，取第2代、第3代的细胞用于实验。

1.2.2 血管环试验 大鼠用木槌击晕后行颈部脱臼，打开胸腔，迅速取出胸主动脉条上段，置于4 ℃的K11溶液中。小心剔除其周围结缔组织后，将血管剪成3 mm长的主动脉环，迅速悬挂至5 mL离体灌流装置中。然后按照1.2.1的操作步骤操作。

1.2.3 建立缺血/再灌注模型[5]大鼠称重后进行麻醉，将其仰卧并固定于手术台上，建立缺血/再灌注模型试验。首先建立模拟缺血，采用纯氮气持续通气，时间为40 min，测定血氧分压小于40 kPa即为模拟缺血。采用纯氧气持续通气大于40 min，即为模拟再灌注；或也可以采用缺血液培养液建立模拟缺血，缺血液培养液配制按照参考文献[6]进行配制，pH=6.5，37 ℃缺氧孵箱内孵育2 h，即为模拟缺血。更换正常培养液，37 ℃ 5% CO2孵箱内孵育4 h即为模拟再灌注。

1.2.4 试验分组 120只大鼠分为对照组、缺血/再灌注模型组、试验组，每组40只。试验组和缺血/再灌注模型组大鼠按“1.2.3”建立的缺血/再灌注模型进行建模，缺血2 h，再灌注4 h，再灌液10 g。试验组给予5 g芪参益气滴丸，缺血/再灌注模型组给予生理盐水；对照组不做任何处理。芪参益气滴丸5 g可以达到最佳的效果[7]。

1.2.5 人体试验 选取有心血管疾病的病人2例，按照缺血/再灌注诱导的心肌微血管内皮细胞试验组实验操作进行人体试验，观察细胞情况。

1.3 观察指标

1.3.1 MTT比色法测定心肌细胞活性[6]取同一批分离的心肌细胞，接种后进行复氧处理1 h。复氧结束后，加20 μL的 MTT培养液进行培养4 h，待结晶物被溶解后采用酶标仪进行测定，在波长490 nm处检测各组的吸光度(A)值作为心肌细胞活性。

1.3.2 TUNEL法检测心肌细胞的细胞凋亡率[8]收集心肌活细胞，按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。在荧光显微镜下进行观察，显示绿色荧光为细胞凋亡。采用DAPI对采集的细胞核进行染色，对每张呈现蓝色荧光的图选取10个视野计数，计数为80个视野，统计内皮细胞总数和凋亡细胞数。细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞/总细胞数×100%。

1.3.3 放射免疫法检测炎症因子 采集3组大鼠的心肌血3 mL，严格按照IL-6、TNF-α试剂盒说明书进行操作。

2 结 果

2.1 各组细胞增殖活性比较 与对照组比较，缺血/再灌注模型组、试验组细胞增殖能力明显降低；试验组与缺血/再灌注模型组比较，试验组细胞增殖能力明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

图1 各组细胞增殖活性比较

2.2 各组心肌细胞的凋亡率比较 与对照组比较，缺血/再灌注模型组、试验组细胞凋亡率明显增加；与缺血/再灌注模型组比较，试验组细胞凋亡率明显降低，具有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组心肌细胞的凋亡率比较(±s)

2.3 各组炎症因子表达能力比较 与对照组比较，缺血/再灌注模型组IL-6水平表达明显升高，TNF-α明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与缺血/再灌注模型组比较，试验组IL-6表达明显降低，TNF-α表达明显升高，具有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组IL-6、TNF-α的比较(±s)

3 讨 论

急性心肌梗死是冠状动脉粥样硬化性心脏病，其斑块的形成是个复杂的过程。采用不同的药物治疗可以减少心肌微血管内皮细胞损伤，芪参益气滴丸对心肌微血管内皮细胞损伤具有保护功效。

缺血性心肌细胞损伤主要以心肌细胞坏死和细胞凋亡两种细胞死亡形式存在[9]。因此将细胞凋亡作为重要指标对缺血性心肌细胞损伤进行分析，可以反映心肌组织的情况，而心肌细胞凋亡受到多种基因与蛋白调控[10]。通过细胞活性和凋亡的研究可以判定不同药物对缺血性心肌损伤的作用，从而为进一步治疗提供可靠依据。黄芪甲苷、丹参素、原儿茶醛、人参皂苷作为芪参益气滴丸中的重要成分，对人体的大脑、心脏、肾脏等重要器官的缺血损伤起到抑制作用。据研究报道显示，采用芪参益气滴丸可以增加缺血性心肌细胞损伤的细胞凋亡，减少细胞增殖活性[11]。本研究结果也支持此论断，芪参益气滴丸可以对缺血/再灌注诱导的心肌微血管内皮细胞损伤起到保护作用。

芪参益气滴丸除了抗疲劳、抗辐射、抑制炎症反应等功效外，更多的研究显示其对细胞的损伤有保护抑制作用。其主要原因是芪参益气滴丸参与了细胞中相关蛋白的反应[12]。也有研究显示芪参益气滴丸可以增加心肌细胞中各种蛋白的表达，芪参益气滴丸的适量添加，提高了心肌缺血后心肌组织对氧化应激损伤的保护作用[13]。

炎症反应在心力衰竭发生时刺激心肌细胞产生促炎症细胞因子，心肌局部促炎症细胞因子生成的重要来源主要是心肌细胞、心肌成纤维细胞，最为重要的是中性粒细胞和巨噬细胞[14]。发生心力衰竭与IL-6、TNF-α的浓度水平密切相关[15]，因此本研究将IL-6、TNF-α作为重要指标进行分析。结果显示芪参益气滴丸可以有效降低IL-6、TNF-α水平，起到抗炎症的作用。

本研究通过建立缺血再灌注损伤模型，对试验组、缺血/再灌注模型组与对照组进行比较，结果发现芪参益气滴丸可以降低细胞增殖能力，增加细胞凋亡率能力，增加IL-6、TNF-α表达能力，减少心肌缺血后心脏组织的损伤，从而起到对缺血再灌注诱导的心肌微血管内皮细胞损伤的保护作用。芪参益气滴丸可减轻缺血再灌注的心肌细胞损伤，主要通过抗炎和抗细胞凋亡途径来实现保护作用。