益气强心饮干预慢性心力衰竭大鼠CaSR及心肌细胞凋亡的实验研究

，

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是临床的常见病及多发病，是多种心血管疾病的严重和终末阶段[1]。随着现今社会生活方式的改变和人口老龄化的日益加重，慢性心力衰竭的患病率和病死率也逐年升高。流行病学调查报告显示，国外慢性心力衰竭的发病率随年龄增加[2]，65岁以上人群可达10%，中国人群心力衰竭发病率为0.08%，老年心力衰竭发病率高于中青年人[3]。本课题从心力衰竭发病机制入手，探讨如何防治慢性心力衰竭。目前研究表明细胞凋亡是心力衰竭发生、发展的重要机制[4]，有效的干预细胞凋亡，可以预防心室重构，是防治慢性心力衰竭的一条全新途径。而研究证实钙敏感受体(Calcium-sensing receptor，CaSR)参与细胞凋亡[5-7]，如何在凋亡的早期阻断CaSR途径介导的心肌细胞凋亡，进一步逆转心肌重构，改善心功能，延缓或逆转心力衰竭的发生发展，成为目前研究的重点课题。本课题组研究益气强心饮干预慢性心力衰竭模型大鼠的钙敏感受体激活及心肌细胞凋亡，以揭示中药益气强心饮治疗及延缓心力衰竭发展的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择雄性Wistar大鼠80只，SPF级，(11±1)周龄，体重(200±20) g，实验动物来源于辽宁长生生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK(辽)2015-0001。所有大鼠以标准大鼠饲料适应性饲养1周。

1.2 实验药品 益气强心饮由辽宁中医药大学附属第二医院煎药室制备，药物组成为制附子、黄芪、葶苈子、泽兰、丹参、红花等。卡维地洛片为北京巨能有限责任公司，生产批号：20150901；盐酸贝那普利片为上海新亚药业闵行公司，生产批号：150701。

1.3 实验仪器及试剂 奥林巴斯BX51显微镜，由日本奥林巴斯生产；BCD-243KA超低温冰箱，由美国生产；LKBV型超薄切片机，由瑞典生产；TUNEL细胞凋亡试剂盒，CaSR免疫组化试剂盒，CaSR抗体，细胞裂解液等购于武汉博士德生物技术有限公司。取材器械由上海医疗器械制造厂生产。

1.4 CHF大鼠模型的建立 根据文献[8-9]，结合预实验经验，采用腹主动脉缩窄改良术式建立 CHF大鼠模型，大鼠经3.5%水合氯醛腹腔[1 mL/(100 g)]麻醉后，采用左侧卧位，于右侧髂腰区备皮，在右肾于右髂腰区的体表投影为中心，作一长(2～3) cm的纵向切口，钝性分离皮肤、筋膜及肌肉，剪开右肾脂肪囊，轻轻牵拉右肾，暴露肾门背侧，沿右肾动脉寻找右肾动脉与腹主动脉的分叉点，在分叉点上方2 mm处分离腹主动脉，然后用外科缝线将一根8号针头与该段腹主动脉一起结扎，再将针头抽出，造成结扎处腹主动脉内径缩窄。假手术组仅分离腹主动脉，但不予以结扎，然后依次还纳各脏器，关腹，缝合切口。术后为预防感染，大鼠均予肌肉注射青霉素每只10 000 U，连续5 d。

在实验大鼠腹主动脉结扎4周后，如大鼠出现呼吸急促、心动过速和劳力性呼吸困难等失代偿性症状，同时完善心脏彩超检测，左室射血分数(LVEF)<50%，则CHF大鼠模型造模成功。

1.5 分组及给药 80只大鼠随机分为假手术组20只、手术组60只。按方法造模后，假手术组死亡2只大鼠，手术组死亡14只。筛选手术组中具有慢性心力衰竭典型表现的大鼠38只，随机分为模型组12只，中药组13只、西药组13只，加上假手术组(n=18)，共4组。各组动物于同等条件下饲养，中药组予益气强心饮，用药量为生药22 g /(kg·d)；西医组予卡维地洛6 mg/(kg·d)，贝那普利10 mg/(kg·d)，按1 mL/(100 g)灌服溶液，每日1次；假手术组与模型组灌服等量生理盐水，每日1次，共8周。

1.6 指标测定

1.6.1 大鼠心功能测定 各组大鼠在用药前及用药8周后均完善心脏超声检查。大鼠称重后，腹腔注射氯胺酮(75 mg/kg)和地西泮(5 mg/kg)，仰卧位固定，胸部备皮，涂耦合剂。使用Vevo 2100 超声仪MS-250心脏探头，频率(13～15)MHz，在左室内径最大处将M型取样线垂直于室间隔和左心室后壁获得M型超声心动图，连续3次测量左心室舒张末期内径(LVIDD)及收缩末期内径(LVIDS)，LVEF取其平均值。同时计算左室射血分数及左心室短轴缩短分数(FS)。

1.6.2 TUNEL法测定大鼠心肌细胞凋亡的数量 光镜下观察正常心肌细胞核呈蓝色，为阴性反应。凋亡细胞核呈深浅不一的颗粒状红色，为阳性反应。根据凋亡阳性细胞在400高倍镜视野下的分布情况，每组标本观察5 张切片，每张切片拍摄5个阳性视野，每视野计数100个心肌细胞，记录其中TUNEL阳性细胞总数，并以每100个细胞中的阳性数为凋亡指数 (apoptotic index，AI)。

1.6.3 大鼠心肌CaSR的Western blot 检测 实验具体步骤按照CaSR的Western blot 检测试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)操作。取0.1 g心肌组织低温研磨后，加入蛋白裂解液，充分裂解后，4℃条件下离心15 min，取上清。以BSA为标准蛋白，用Bradford法对所取上清进行蛋白定量。取20 μg蛋白，进行10%SDS-PAGE电泳，然后在100 V，时间1 h，转印至硝酸纤维素膜上。该膜浸没在Western blot封闭液中(TBST溶解的5%脱脂奶粉，pH7.4)，37 ℃封闭1 h，加入CaSR抗体(1∶2 000)中孵育过夜。TBST反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶标记的抗Ig抗体(1∶1 000)孵育，37 ℃轻摇1 h，再反复洗膜，之后用Western blue 显迹，同时用β-actin抗体(1∶500)为内参，用不加CaSR抗体作为阴性对照。

2 结 果

2.1 大鼠心功能测定 造模后与假手术组相比，手术组大鼠 LVEF 明显下降，有统计学意义(P<0.05)；手术组与假手术组相比，FS明显降低，有统计学意义(P<0.05)；与假手术组相比，手术组 LVIDD升高，有统计学意义(P<0.05)；两组 E/A 值相比具有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图 1。

表1 两组大鼠心功能超声检测结果(±s)

图1 两组大鼠心脏超声结果

2.2 各组大鼠心肌组织CaSR蛋白的表达(见表2) 假手术组与其他各组比较，心肌细胞的CaSR蛋白含量较低， 有统计学意义(P<0.05)；模型组与其他用药组比较，心肌细胞CaSR蛋白含量较高有统计学意义(P<0.05)，但中药组与西药组相比无统计学意义，表明中药组和西药组心肌细胞CaSR蛋白含量相当。从 CaSR电泳图(见图 2)可以看出，模型组的电泳条带最宽，而假手术组最窄，中药组和西药组次之，GAPDH各组之间宽窄程度均一。

表2 各组CaSR 蛋白表达的比较(±s)

图2 各组 CaSR 蛋白表达

2.3 各组大鼠心肌组织细胞凋亡情况 在显微镜下观察，正常细胞核不被染色因而看不到，而经TUNEL法染色后，凋亡的细胞核呈棕黄色。假手术组与其他各组比较，心肌细胞凋亡指数最低(P<0.05)；模型组心肌细胞凋亡指数最高，而中药组和西药组次之(P<0.05)；中药组与西药组比较差异无统计学意义，两组心肌细胞凋亡指数相当。详见表 3。

表3 各组心肌细胞凋亡指数比较(±s) %

3 讨 论

目前心力衰竭的患病率和病死率呈现快速增长的趋势[10-11]，《中国心血管病报告2016》中提到我国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段，推算我国的心力衰竭病人高达 450 万人，慢性心力衰竭病人的平均发病年龄呈上升趋势，为66岁±15岁，心血管病死亡率仍高居首位[12]，而心力衰竭是导致心脏病病人死亡的最主要原因，心力衰竭病人5年内的死亡率为50%[13-14]。防治心力衰竭成了治疗心血管疾病的重中之重。

如今慢性心力衰竭研究日益深入，早已从体液潴留、泵功能障碍学说过渡到现在的神经内分泌系统过度激活等导致的心室重构学说，而心肌细胞凋亡就参与其中，是慢性心力衰竭发生、发展的重要机制[15]。细胞凋亡是细胞程序性死亡，对细胞的生长和发育起着重要的作用[16]，心肌细胞凋亡时大量心肌细胞减少，心肌细胞减少会导致心脏泵功能丧失，而细胞凋亡后，在凋亡附近的细胞重排，发生心肌重构，重构也会使心脏收缩功能进一步下降。如果能在早期阻断细胞凋亡，就可以延缓或逆转心力衰竭的发生发展。

CaSR作为G蛋白偶联受体超家族中C家族的成员之一，主要是调控机体钙平衡[17]。近年来研究证实CaSR通过激活Fas/FasL的受体通路，促进心肌细胞凋亡[18]，CaSR能直接诱发细胞内钙超载，导致心肌细胞凋亡[5]，CaSR可通过肌浆网上的IP3受体释放大量钙离子，进入线粒体后引发心肌细胞[19]，CaSR还可诱导内质网紧张，通过内质网通路促进心肌细胞凋亡，从而导致心力衰竭的发生发展[6]。有效控制CaSR过度激活，阻断其传导通路，可以有效抑制细胞凋亡，抑制慢性心力衰竭的发展，达到治疗及延缓心力衰竭的目的。

本实验发现CHF时模型组大鼠心肌组织的CaSR蛋白表达与假手术组比较明显升高(P<0.05)，同时模型组大鼠心肌细胞凋亡指数与假手术组相比也具有统计学意义(P<0.05)，两者升高具有同步性。这证实了细胞凋亡参与慢性心力衰竭的发生、发展，同时CaSR参与了心肌细胞凋亡过程。本实验显示：①中药益气强心饮能下调CaSR蛋白表达，与模型组相比具有统计学意义，中药组、西药组相比较疗效相当；②中药组、西药组与模型组相比，心肌细胞凋亡指数均有下降，有统计学意义，中药组和西药组相比疗效相当，证明两者作用相似。益气强心饮可下调慢性心力衰竭大鼠心肌组织钙敏感受体蛋白表达及心肌细胞凋亡指数，疗效等同西药对照组。这证实了益气强心饮可抑制心肌细胞凋亡，具有治疗及延缓心力衰竭发展等的作用。

慢性心力衰竭的中医病机应为本虚标实之证，以气虚、阳虚为本，以血瘀、水停为标，治疗原则以益气温阳、活血利水为主，其中益气温阳为治病之根，活血利水为治病之要，二者缺一不可。益气强心饮是在多年临床经验基础上改进完善而创立的经验方，在前期工作中，通过临床反复论证，证实益气强心饮可改善慢性心力衰竭病人临床症状，降低病人BNP水平，提高6 min步行试验距离[20]。益气强心饮主要由红参、黄芪、制附子、泽兰、葶苈子等药物组成，具有益气温阳、活血利水之功效，全方可益气活血，气充血行，温阳利水，阳充水散，具有标本并治之功，且以补为通，补中寓通，通补兼施，相得益彰。

益气强心饮可干预慢性心力衰竭时大鼠CaSR的激活及心肌细胞凋亡，改善心功能，抑制心肌重构，治疗及延缓心力衰竭的发生发展，具有抗心力衰竭的作用，在慢性心力衰竭治疗方面有着广阔的前景。