新疆哈萨克族CETP基因多态性与血脂及高脂血症中医证型的关系

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血脂研究已经越来越受到人们的关注，高血脂危害着人们的健康，是引起冠心病、高血压、脑梗死等心脑血管疾病的重要原因[1]。血脂异常是指人体内多余的脂蛋白在血管内堆积的过程，高脂血症是指高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低，以及三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的异常增高，其中的任何一项或几项异常均可以被认为是血脂异常[2]。血脂异常的患病率在全世界范围内不断增长，在我国普通成人血脂报告中显示，新疆哈萨克族人口血脂异常患病率为31.8%[3]。血脂异常与冠心病、糖尿病、脑梗死等心脑血管疾病的发生密切相关，严重危害人们的身体健康，血脂异常的形成与多种因素相关，其中包括运动、饮食、生活习惯和基因遗传等因素，其中遗传因素的作用越来越受到人们的关注[4]。流行病学调查显示，5%血脂异常与基因遗传相关[5]。本研究探索新疆哈萨克族CETP基因多位点和血脂异常之间关系，从基因角度探索血脂异常的发病机制。以期为哈萨克族血脂异常的预防和治疗在基因水平提供一种新的方法，为心血管和脑血管疾病的预防和治疗提供遗传基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象 以新疆乌鲁木齐市为调查地点，对哈萨克族聚集区进行采样，采用随机整群抽样的方法收集符合标准的研究对象建立标本库。从前期建立的人群标本库随机抽取符合纳入标准的研究对象448例(其中高脂血症病人218例)。在这448例研究对象中，男女比例1.009∶1，男性225例，女性223例，年龄18岁～70岁(51.58±11.37岁)；身高(165.1±7.8) cm；体重(73.78±14.61)kg。该研究为国家自然科学基金资助的项目(No.81160429)，通过新疆医科大学第四附属医院伦理委员会许可。

所有合格研究对象均在入选前给予告知检查指标的详情和利弊，并签署知情同意书。选择同期健康体检者230名作为健健对照组。

1.2 病例收集 课题组制定《新疆不同民族高脂血症易感因素的流行病学调查研究调查表》，对性别、年龄、身高、体重指数(BMI)、腰围、民族、体重、饮食、运动、吸烟、饮酒和中医证候等信息进行分析研究。探索易感因素与高脂血症发病关系及与中医证型的关系[6]。西医诊断及纳入标准：根据2002年版《中国成人血脂异常防治指南》规定：TC≥6.22 mmol/L，或TG≥2.26 mmol/L，或LDL-C≥4.14 mmol/L，或HDL-C≤1.04 mmol/L；且年龄18岁～70岁的哈萨克族居民[7]。排除标准：心肌梗死、脑梗死、外伤或重大手术后者；严重的心、肝、肾等重大疾病和免疫系统疾病者。中医辨证分型标准：参照中华人民共和国卫生部2002年制定的《中药新药临床研究指导原则》与分型标准[8]，分为肝肾阴虚证、脾肾阳虚证、痰浊阻遏证、阴虚阳亢证、气滞血瘀证5型。中医证候分型参照《中医临床诊疗术语证候部分》判断标准[9-10]。

1.3 血液标本采集 受试者空腹12 h，晨起采集5 mL静脉未抗凝血，在2 h内离心分离血清，送检验科检测，包括血脂七项、空腹血糖(Glu)。采用自动分析生化分析仪完成检测。另外3 mL血用拘橼酸钠抗凝剂(anticoagulant ACD)抗凝，保存在-20℃冰箱中待提取基因组DNA使用[11]。

1.4 基因分型 用人体血液基因组DNA提取DNA(试剂盒由上海来枫生物科技有限公司提供)。采用上海生物公司提供的SNP分型试剂盒，对448个样本进行SNP位点分型。①CETP基因A373P、c.*84G>A突变位点所在区段先采用PCR扩增。②扩增后的产物经核酸酶外切纯化后用于后续连接酶的反应[12]。③根据美国国家生物技术中心(NCBI )提供的A373P、c.*84G>A(rs1801706，rs5880)[11]。④序列，使用Primer5.0软件进行特异性引物设计并进行比对。引物序列由上海生工工程公司合成，上游及下游引物序列分别为rs1801706F：GGTCGGGATGGGGCTTGTAG和rs1801706R：GGGAGGAGTTGGGAGCCAATr；rs588oF：GAGCCCTGGCTCACAGCAA和rs5880R：TGACCGCCCCCTCTCTTCTC[13]。采用上海天昊生物公司的imLDRTM 多重SNP分型试剂盒对448个样本进行2个SNP位点分型。目标SNP位点所在区段先采用多重PCR反应在一个体系中获得扩增。扩增产物经外切核酸酶及虾碱酶(ExoI/SAP)纯化后用于后续连接酶反应的模板[14]。在一个连接反应中，每个位点包含两个5′端等位基因特异探针(其3′末端分别为两个等位基因特异碱基或序列——对插入缺失多态而言)以及紧挨其后的一条3′端位点的荧光标记的特异探针。连接产物通过ABI3730XL的毛细管电泳来区分，原始数据文件用GeneMapper4.1软件(appliedbiosystems)来分析[15]。

2 结 果

2.1 高脂血症组与健康对照组间临床资料比较 两组间年龄、性别、身高构成比比较差异无统计学意义(P>0.05 )，BMI、腰围、食用肉制品比较差异有统计学意义(P<0.01)。而吸烟、饮酒、运动则差异无统计学意义(P>0.05 )。高脂血症组较血脂健康组体重更重、腰围更宽、BMI指数更高、食用肉制品更多，和饮食偏嗜关系则不大，与是否运动也无统计学意义。血脂异常是一个多因素共同作用的结果，而饮食起到了关键作用。详见表1。

2.2 新疆哈萨克族c.*84G>A和A373P位点基因型和等位基因频率 新疆哈萨克族高脂血症病人rs1801706(A373P)位点，AA、 AG和GG基因型频率分别为3例(1.4%)、39例(17.9%)和176例(80.7%)，GG基因型最多，AG基因型其次，AA基因型最少，纯合子最多，突变纯合子最少，A373P位点很少发生突变，且与高脂血症的发生没有必然联系。从等位基因频率观察G等位基因占89.7%，但与健康对照组相比变化并不显著，G等位基因与高脂血症的发生发展并没有必然的联系[17]，表明G等位基因并不是血脂的保护因素或者危险因素。从健康对照组中观察到AA、AG和GG基因型频率分别为2例(0.9%)、35例(15.2%)和193例(83.9%)；GG基因型占多数。高脂血症组中 A和G的等位基因频率分别为10.3%和89.7%，健康对照组中A和G的等位基因频率分别为8.5%和91.5%。高脂血症与对照组中等位基因之间差异无统计学意义[18]。

新疆哈萨克族高脂血症组中rs5880(c.*84G>A)位点CC、CG和GG基因型频率分别为0例(0.0%)，11例(5.0%)和207例(95.1%)，健康对照组中CC、CG和GG基因型频率分别为0.0%、7.4%和92.6%；高脂血症组中C和G的等位基因频率分别为2.5%和97.5%，健康对照组中C和G的等位基因频率分别为3.7%和96.3%。c.*84G>A位点基因型与等位基因频率在高脂血症组和健康对照组中差异无统计学意义[19]。详见表2。

表1 高脂血症组与健康对照组临床资料比较

表2 两组c.*84G>A和A373P位点基因型和等位基因频率分布 例(%)

两组人群皆符合Hardy-Weinberg平衡定律，基因多态性哈迪温伯格平衡检验符合人群分布(P>0.05)。新疆哈萨克族高脂血症病人与健康对照组的CETP基因c.*84G>A、A373P位点基因型和等位基因频率的分布无统计学意义(P>0.05)[20]。

2.3 新疆哈萨克族c.*84G>A和A373P位点基因型与血脂水平的关系 新疆哈萨克族CETP基因A373P基因型高脂血症组和对照组间血浆TC、LDL-C差异有统计学意义。rs1801706位点高脂血症中G等位基因携带者(AG、GG基因型)较非G等位基因携带者(AA基因型)有更高的血浆TC(P<0.05)[21]；健康对照组中则无统计意义。rs1801706高脂血症组G等位基因携带者较非G等位基因携带者有更高的血浆TC水平(P<0.05 )。

新疆哈萨克族CETP基因rs5880 (c.*84G>A)位点多态性基因型高脂血症组和健康对照组之间血浆TC有差异。rs5880位点高脂血症中G等位基因携带者(GG基因型)较G等位基因携带者有更高的血浆TC水平(P<0.05)[22]；健康对照组中无统计学意义。rs5880高脂血症组GG基因型较CG基因型有更高的血浆TC水平(P<0.05 )。详见表3。

表3 两组基因型与血脂水平的关系(±s) mmol/L

2.4 基因多态性型与中医证型的关系

2.4.1 新疆哈萨克族高脂血症中医辨证分型 高脂血症病人共218例，根据《中药新药临床研究指导原则》分型标准，共分为肝肾阴虚、脾肾阳虚、阴虚阳亢、痰浊阻遏、气滞血瘀5型。其中肝肾阴虚证41例(18.8%)，脾肾阳虚证35例(16.1%)，痰浊阻遏证87例(39.9%)，阴虚阳亢证有18例(8.3%)，气滞血瘀证37例(17.0%)。

2.4.2 新疆哈萨克族高脂血症病人CETP表型及等位基因分布 218例高脂血症病人中(A373P)位点共检出纯合子(GG)、杂合子(AG)和突变纯合子(AA)3种基因型，rs1801706基因型以GG纯合子占大多数，共176例(80.7%)，AA突变纯合子最低，仅有3例(1.4%)；等位基因频率则以G最高，占89.7%。rs5880 (c.*84G>A)位点共检出纯合子(GG)、杂合子(CG)和突变纯合子(CC)3种基因型，rs5880 c.*84G>A位点以GG纯合子占大多数，共207例占95.0%，CC突变纯合子则没有检测出[23]；等位基因频率则以G最高，占97.5%。

2.5 中医证型与CETP基因型比较 rs1801706位点GG基因型中痰浊阻遏证最多，有70例；其次为肝肾阴虚和脾肾阳虚证，分别为36例和28例。AG基因型中痰浊阻遏最多(16例)，其次为气滞血瘀型11例。AA基因型所有证型都很少，脾肾阳虚2例，痰浊阻遏1例。等位基因频率A等位基因中痰浊阻遏与气滞血瘀最多，分别为18例和11例。G等位基因中痰浊阻遏与肝肾阴虚最高，分别为156个和77个。进一步统计学分析表明，在GG、AA、AG基因型构成比中存在差异，痰浊阻遏高于肝肾阴虚，肝肾阴虚高于脾肾阳虚，脾肾阳虚高于气滞血瘀，气滞血瘀高于阴虚阳亢[24]。详见表4。

2.6 中医证型c.*84G>A基因型比较 rs5880位点GG基因型中痰浊阻遏证最多有80例；其次为肝肾阴虚和气滞血瘀，分别为40例和35例，CG基因型中痰浊阻遏最多7例，其次为气滞血瘀型有2例。CC基因型则未检测出来。等位基因频率G等位基因中痰浊阻遏与肝肾阴虚最多，分别为167个和81个。A等位基因中痰浊阻遏与肝肾阴虚最高，分别为7个和12个。进一步统计学分析表明，在GG、CC、CG基因型构成比中存在差异，痰浊阻遏高于肝肾阴虚，肝肾阴虚高于脾肾阳虚，脾肾阳虚高于气滞血瘀，气滞血瘀高于阴虚阳亢。新疆哈萨克族高脂血症病人CETP基因c.*84G>A位点CC基因型未检测出，说明在c.*84G>A位点中未发生突变。突变只占少部分，多数中医证型都没有发现突变[25]。详见表5。

表4 A373P基因多态性与高脂血症中医证型的关系(n=218) 例(%)

表5 c.*84G>A基因多态性与高脂血症中医证型的关系 例(%)

3 讨 论

本研究入选的高脂血症人群和健康对照者之间在身高、性别、运动等一般特征比较无统计学意义[26]，但是在食用肉制品、腰围、BMI的比较有统计学意义，嗜食肥甘、体型过胖是造成哈萨克族血脂异常的主要原因，更是哈萨克族高脂血症患病率高的一个独立危险因素，所以改变饮食习惯对于哈萨克族降低血脂尤为重要[27]。哈萨克族是一个游牧民族，多聚集在一个地方[28]，高脂血症发病率越来越高，改变饮食习惯很重要。

在新疆哈萨克族中CETP基因rs1801706多态性与血脂异常的发生密切相关； 位点rs1801706 与rs5880 G等位基因的频率对于血脂异常的哈萨克族人口是保护性因素。然而，rs1801706 A等位基因则是风险因素。新疆哈萨克族CETP基因rs5880 (c.*84G>A)基因型高脂血症组和健康对照组之间血浆TC有统计学意义。rs5880 (c.*84G>A)位点多态性基因型高脂血症组和健康对照组之间血浆TC有统计学意义。rs1801706位点高脂血症中G等位基因携带者(AG、GG基因型)较非G等位基因携带者(AA基因型)有更高的血浆TC水平(P<0.05)；健康对照组中则无统计学意义[29]。rs5880高脂血症组G等位基因携带者较非G等位基因携带者(CC基因型)有更高的血浆TC水平(P<0.05 )。基因突变占少数，有意义的突变更是很少，基因纯合子为最多，突变杂合子rs1801706 (A373P)位点中很少，rs5880 (c.*84G>A)则未检测出有突变。

高脂血症为中医的血中痰浊，中医认为血浊、血中脂质浓度升高是血中痰浊的主要物理基础[30]。本研究结果显示rs1801706位点GG基因型与病人的TC浓度升高有显著相关性。由此推测rs1801706位点AA基因型可能与高脂血症痰浊阻遏证候发生有密切关系，有可能是高脂血症痰浊阻遏证的易感基因之一。所以清淡饮食和适当运动将更有利于防治或延缓高脂血症的发生和发展。可以看出rs1801706位点GG基因型中痰浊阻遏证最多，其次为肝肾阴虚和脾肾阳虚。所以GG基因型是高脂血症痰浊阻遏的易感因素。AG基因型中痰浊阻遏最多，其次为气滞血瘀型。AA基因型与痰浊阻遏的关系不明显。AA基因型所有证型都很少，脾肾阳虚2例，痰浊阻遏1例。AA基因是高脂血症的保护因素[31]。rs5880位点GG基因型中中医证型的比例依次为痰浊阻遏证>肝肾阴虚>气滞血瘀。CC基因型在rs5880位点则未检测出来。说明在c.*84G>A位点中未发生突变。突变只占少部分，多数中医证型都没有发现突变。等位基因频率G等位基因中痰浊阻遏为156例，占大多数，所以G等位基因是痰浊阻遏的易感因素。

在GG、AA、AG基因型构成比中存在差异，痰浊阻遏高于肝肾阴虚，肝肾阴虚高于脾肾阳虚，脾肾阳虚高于气滞血瘀，气滞血瘀高于阴虚阳亢。高脂血症中痰浊阻遏的占比较多，这与哈萨克族嗜食牛羊马肉、饮酒有密切的关系，肉能生湿生痰，酒能助湿，造就了哈萨克族多以痰浊体质为主，痰浊体质者易患高脂血症，是高脂血症的易感因素，从基因层面分析看， GG基因型与血脂异常有相关性，所以GG基因型是高脂血症易感因素，开展此项研究治疗哈萨克族高脂血症病人，尤其是中医治疗高脂血症时应重视基因型，为哈萨克族预防血脂异常，防治心脑血管疾病提供了指导。