蒙药蒙根窍吉散质量标准中含量测定方法的建立△
2019-01-16李柱吕颖张海涛王杰张春红李旻辉
李柱,吕颖,张海涛,王杰,张春红*,李旻辉,4*
(1.内蒙古额济纳旗蒙医医院,内蒙古 额济纳旗 735400;2.赤峰市药品检验所,内蒙古 赤峰 024000;3.内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古 包头 014060;4.内蒙古自治区中医药研究所,内蒙古 呼和浩特 010110)
蒙药蒙根窍吉散为内蒙古西部常用蒙药制剂,由锁阳、沙枣果、骆驼奶酪、冰糖等配方组成,有强壮、镇静、固精、止泻、调经等功能,临床上主要用于治疗胃痛、腹泻、身体虚弱、肺热咳嗽等疾病,其效果显著。由于目前评价蒙根窍吉散质量的检测方法水平较低,指标较少,尚无薄层鉴别、含量测定等控制指标,无法满足当前国家、自治区对蒙医药制剂的质量评价要求,无法更好地指导临床用药。因此本文利用高效液相色谱分析技术,以蒙根窍吉散中主要药效成分槲皮素、异鼠李素及儿茶素为考察指标,建立了含量测定方法,该方法简单快捷,结果准确可靠,为提高蒙药蒙根窍吉散的质量标准水平提供了借鉴和参考。
1 仪器与试药
1.1仪器
Agilent 1120液相色谱仪、EZChrom Elite色谱工作站;Thermo Fisher ScientificUltiMate3000高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司];METTLER TOLEDO AB-135S型电子分析天平、FA1104型电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司);KT-300 TDV型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);MILLI-Q 超纯水制备仪(Millipore,Bedford,MA);VDRTEX-5涡旋混合器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司);微量移液器(Eppendorf,Germany)。
1.2 试药
对照品槲皮素(批号100081-201610,纯度>99%)、异鼠李素(批号110860-201410,纯度>99%)、儿茶素(批号100081-201610,纯度>94%)均购自中国食品药品检定研究院;色谱纯甲醇、乙腈、醋酸均购自Fisher公司(Nepean,Ont.,Canada);磷酸、盐酸试剂均为分析纯,均购自国药集团化学试剂有限公司;水为超纯水,制备于Milli-Q超纯水仪(Millipore,Bedford,MA)。
3批蒙根窍吉散均为额济纳旗蒙医院院内制剂(批号分别为20170103、20170108、20170116);沙枣果阴性对照供试品:按处方比例以相同工艺制备缺沙枣果的阴性对照供试品;锁阳阴性对照供试品:按处方比例以相同工艺制备缺锁阳的阴性对照供试品。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
槲皮素、异鼠李素混合对照品溶液:分别精密称取对照品槲皮素、异鼠李素各7 mg于50 mL棕色容量瓶中,加入甲醇使其溶解,并定容至刻度,制槲皮素、异鼠李素质量浓度分别为141.9、140.5 μg·mL-1的混合对照品溶液,即得。
儿茶素对照品溶液:精密称取儿茶素对照品1.5 mg于25 mL棕色容量瓶中,加稳定溶液(分别取新鲜配制的0.03 mol·L乙二胺四乙酸溶液25 mL、0.06 mol·L-1抗坏血酸溶液25 mL、乙腈50 mL,至500 mL量瓶,加水稀释至刻度,摇匀,即得)使其溶解,并定容至刻度,制得质量浓度为580.0 μg·mL-1儿茶素对照品溶液,即得。
2.2 供试品溶液制备
供试品a(用于检测槲皮素、异鼠李素):精密称取样品及沙枣果阴性对照供试品2.0 g,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇-盐酸(10∶1)混合溶液50 mL,密塞,称定重量,静置30 min。置60 ℃水浴超声处理1 h(功率为250 W,频率为50 kHz),放冷,再称定重量,用甲醇-盐酸(10∶1)混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
供试品b(用于检测儿茶素):精密称取样品及锁阳阴性对照供试品2.0 g,置50 mL量瓶中,加70%甲醇25 mL,70 ℃水浴浸泡10 min,超声处理(功率为250 W,频率为50 kHz)20 min,放冷,加稳定溶液至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.3 色谱条件
槲皮素、异鼠李素含量测定色谱条件:Diamonasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.4%磷酸水(47∶53)等度洗脱;流速:1 mL·min-1;柱温为25 ℃;检测波长为370 nm;进样量为10 μL。
儿茶素含量测定色谱条件:Agilent ZORBAX C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:以乙腈-乙酸-0.03mol·L-1乙二胺四乙酸-水(9∶2∶0.2∶88.8)溶液为流动相A;乙腈-乙酸-0.03 mol·L-1乙二胺四乙酸-水(80∶2∶0.2∶17.8)溶液为流动相B,按表1中规定进行梯度洗脱[1];流速:1 mL·min-1;柱温:35 ℃;检测波长:278 nm;进样量:10 μL。
表1 儿茶素含量测定梯度洗脱条件
2.4 方法学考察
2.4.1 专属性试验 分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照供试品溶液各10 μL,在2.3色谱条件下分别测定。结果显示,沙枣果阴性对照供试品溶液、锁阳阴性对照供试品溶液在与槲皮素、异鼠李素混合对照品、儿茶素对照品及供试品溶液色谱相应保留时间处未出现干扰色谱峰,表明在本实验条件下槲皮素、异鼠李素、儿茶素与其他组分峰完全分离,专属性强。色谱图见图1。
注:A1.沙枣果阴性对照供试品;B1.对照品;C1.供试品a;1.槲皮素;2.异鼠李素;A2.锁阳阴性对照供试品;B2.对照品;C2.供试品b;3.儿茶素。图1 阴性对照供试品、对照品及蒙根窍吉散供试品HPLC图
2.4.2 线性关系 在2.3槲皮素、异鼠李素含量测定色谱条件下,分别精密吸取槲皮素、异鼠李素混合对照品溶液2、4、6、8、10 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积,以峰面积(Y)与对照品进样量(X)进行线性回归,得到槲皮素和异鼠李素回归方程、相关系数及线性范围。结果见表2,表明槲皮素在0.283 8~1.419 1 μg,异鼠李素在0.280 9~1.404 6 μg线性关系良好。
在2.3儿茶素含量测定色谱条件下,分别精密吸取儿茶素对照品溶液2、5、10、15、20 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积,以峰面积(Y)与对照品进样量(X)进行线性回归,得到儿茶素回归方程、相关系数及线性范围。结果见表2,表明儿茶素在0.115 5~1.155 5 μg线性关系良好。
表2 槲皮素、异鼠李素、儿茶素的线性方程、相关系数、线性范围
2.4.3 精密度试验 精密吸取2.1项下的对照品溶液,按上述色谱条件下重复测定6次,结果槲皮素、异鼠李素、儿茶素峰面积的RSD分别为0.94%、0.63%、0.51%,表明仪器精密度良好。
2.4.4 稳定性试验 精密称取蒙根窍吉散样品2.0 g,按2.2项下方法制备供试品溶液。在上述色谱条件下,分别于0、5、10、20、24 h进样10 μL,记录槲皮素、异鼠李素、儿茶素的峰面积,计算相对标准偏差。结果显示,供试品槲皮素、异鼠李素、儿茶素的峰面积RSD分别为0.18%、0.89%、1.77%(n=6),表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4.5 重复性试验 精密称取2.0 g同一批号蒙根窍吉散样品(批号:20170108)6份,按2.2项下方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下进样10 μL,分别记录槲皮素、异鼠李素、儿茶素的峰面积,计算平均含量的相对标准偏差RSD分别为0.87%、1.26%、1.69%(n=6),表明本方法重复性良好。
2.4.6 加样回收率试验 精密称取1.0 g已知含量的样品(批号:20170108)9份,分别精密加入适量的对照品溶液[2],按2.2项下方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下进行测定,结果见表3。槲皮素、异鼠李素、儿茶素的加样回收率RSD分别为92.05%、94.00%、91.25%(n=9),表明本方法准确性高。
表3 蒙根窍吉散中槲皮素、异鼠李素、儿茶素的加样回收率试验(n=9)
2.5 样品的含量测定
精密称取不同批号蒙根窍吉散样品各3份,按2.2项下方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下,分别进样10 μL测定,分别记录峰面积并计算样品含量,结果见表4。由结果可知,按干燥品计算,槲皮素(C15H10O7)、异鼠李素(C16H12O7)、儿茶素(C15H14O6)平均含量分别为0.11、0.12、0.62 mg·g-1。
表4 蒙根窍吉散中槲皮素、异鼠李素及儿茶素的平均含量(n=3)mg·g-1
3 讨论
蒙根窍吉散由沙枣、锁阳等配方组成,其中沙枣果为方中君药,所占处方比例较大,具有强壮、镇静、固精、健胃、止泻等功能。其化学成分主要有:挥发油、生物碱、黄酮、芳香族、酚酸类成分(没食子酸、咖啡酸等)、鞣质、糖类(还原糖、蔗糖)、蛋白质、氨基酸、脂肪、淀粉、粗纤维、总酸、维生素和矿物质等[3]。通过文献分析,槲皮素和异鼠李素的药理作用与沙枣的主要药理作用相吻合[4],推断槲皮素和异鼠李素是沙枣的主要活性成分之一,因此把二者作为沙枣的指标性成分,进行了HPLC含量测定方法研究,效果较理想。经分析方法验证,表明该方法重复性好、专属性强,方中其他组分对槲皮素、异鼠李素的测定无干扰,故拟收入质量标准中。
锁阳为方中臣药,亦称不老药,历来作为中医常用的补肾壮阳药,临床用于补肾阳、精血、润肠通便等[5]。其化学成分主要有:黄酮类化合物[(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、表儿茶素、异槲皮苷、柑桔素等]
三萜类(熊果酸、乙酰熊果酸、齐墩果酸丙二酸半酯等)、糖和糖苷类、鞣质类、木脂素类、有机酸(没食子酸、原儿茶素、琥珀酸等)、甾体类、挥发性成分、氨基酸类等[6],根据其所含有的主要化学成分及其主要药理作用,推断其有效成分可能是儿茶素、熊果酸、多糖、鞣质等。通过大量文献分析,儿茶素在锁阳中含量较高,其药理活性与锁阳的主要药理作用相吻合[7-8],因此把儿茶素作为控制锁阳药材质量的指标性成分,对其进行了含量测定方法研究。经分析方法验证,方中其他组分对儿茶素的测定无干扰,但回收率偏低(约63%)。通过进一步分析发现,儿茶素类成分之间互为同分异构体,在热水浸提过程中有部分组分相互转化,使测得结果含量偏低。经反复摸测,供试品前处理过程中加入稳定溶液后,发现该方法重复性好、专属性强,回收率达90%以上,故拟收入质量标准中。
其他成分如粗多酚、粗多糖[9],虽具有较广的生物活性,但天然含量低、分离困难、质量标准不易控制、分子结构难以测定;鞣质可能具有非常好的药理作用,但其是一类比较复杂的多元酚类化合物,更好的药理作用还需进一步的实验证明[10]。因此,未对以上成分作进一步分析。