基于组分配伍探讨黄连黄芩保肝的物质基础△

2019-01-16段玉红苏虹霞杨红莲

中国现代中药 2018年12期

段玉红，苏虹霞，杨红莲

(陕西中医药大学附属医院内分泌二科，陕西咸阳 712000)

现在随着药物种类的不断增多，药物性肝病的发生也逐年增加。对乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)也叫扑热息痛，为临床常用解热镇痛药，在大多数国家是非处方药，为经典的解热镇痛药[1]，在正常剂量服用是安全的，然而大剂量服用时会导致肝毒性。APAP成药规格不同、种类多，包括多种复方制剂，在使用和销售过程中都比较随意，造成大量的不良反应。其中比较严重、不能忽视的是APAP对肝脏的损伤。更为严重者会引发肝功能衰竭，甚至危及生命[2-3]。研究者发现人体服用过量的APAP，经过细胞色素P450酶代谢，CYP450是人体重要的I相药物代谢酶，种类繁多，可分为不同的家族，能代谢和转化外源性和内源性化合物，减弱化合物的毒性或者使其毒性丧失。

已有研究报道，许多中药能保护APAP造成的肝损伤[4-6]；而且中药副作用小，临床应用更广泛[7]。黄连(Rhizoma coptidis)是毛茛科植物三角叶黄连或云连的干燥根茎，中国传统中药，具有清热燥湿、泻火解毒的功能[8]。其主要含有生物碱、小檗碱、黄连碱、黄连宁、巴马汀等化学成分。现在药理学研究表明，黄连具有降血糖、保肝、抗癌、免疫调节、改善心血管、降血压等药效[9-10]。黄连作为清热解毒中药，不仅药理作用广泛，还有较高的临床应用价值。黄芩(Scutellaria baicalensis)为唇形科植物黄芩的根部，其在保肝、抗病毒、抗菌、抗氧化、消除自由基、抗过敏、保护神经元等多方面发挥作用[11]。临床上黄芩素胶囊能有效治疗急性肝炎。黄芩、黄连配伍使用在许多经典方剂中都有体现[12]，黄芩、黄连药对始见于唐代王煮《外台秘要》中的黄连解毒汤[10]，方中黄芩与黄连的配伍比例为1∶1，也出自于《伤寒论》，目前也已经成为临床上常用的治疗2型糖尿病、肠道菌群等疾病的药对之一。CYP450酶是体内重要的代谢酶，尤其对毒性化合物在体内代谢发挥重要作用，但是黄连、黄芩有效化学成分对CYP450亚酶活性的影响尚不明确，所以本实验基于计算机模拟技术研究黄连、黄芩化学成分与CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP2C9的相关性，预测可能结合的作用靶点，进一步从分子水平上探讨黄连、黄芩保肝的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 配体库的构建基于TCMSP和TCM@taiwan网络药理学平台筛选黄连-黄芩的化学成分，参照Lipinski 五规则的相关指标，符合 Lipinski 5个规则更有可能成为口服药物，多数认为具有较好的ADME(absorption，distribution，metabolism，excretion)性质[13]。黄连、黄芩化学成分筛选需要同时满足：DL(类药性)≥0.18，MW(分子量)≤500，2≤AlogP(脂水分配系数的对数值)≤5，OB(口服生物利用度)≥40%。OB受多种因素的影响，很多新药在开发过程中没有达到标准的OB，不能开发到临床。一般认为 DL≥0.18 的分子具有较好的类药性。通过Drug Bank筛选阳性药[14]，谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)可以解救大剂量对乙酰氨基酚造成的药物性肝损伤。谷胱甘肽在机体内是重要的自由基清除剂，同时也具有抗氧化能力。可以把机体内有毒的物质转化为无毒物质，排出体内。N-乙酰半胱氨酸是巯基供体，能快速解救对乙酰氨基酚引起的肝损害。所有的化合物采用Open Babel-2.4.1 构建成三维结构，并对其加电荷、加氢，保存为mol2 格式。

1.1.2 CYP450亚酶晶体结构的准备 CYP450亚酶晶体结构从PDB库(Protein Data Bank)中下载，CYP2E1、CYP3A4、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9的 PDB ID分别为3E6I、4NY4、2HI4、4WNU、4NZ2[14]。生物学效应见表1。

表1 靶标蛋白的基本信息

1.2 基于iGEMDOCK 进行虚拟筛选

iGEMDOCK是一个开源的分子对接软件[18]，操作简单，对接准确度较高，主要用于初筛和精度对接。小分子和大分子在进行构象匹配时，通用的标准对接方法为：子代(Generation)=70，Number of solution(解的个数)=2，generic evolutionary method中群体大小(population size)设为200。对黄连、黄芩化合物和CYP450亚酶的结合腔穴进行对接。让小分子和大分子在几何、能量匹配的原则上相互识别，寻找与CYP450亚酶匹配能量最低的小分子。在构象搜索过程中，该软件考虑了氢键、范德华力和静电作用进行经验打分。

1.3 网络模型的构建

基于Cytoscape构建黄连、黄芩和CYP450亚酶的网络模型，现在用于网络分析的工具主要有Cytoscape、数据可视化工具Gephi、Wireshark等，其中应用比较广泛的为Cytoscape，其为一款开源的可视化软件，操作简单、快速，可以系统整合复杂的分子之间的相关性[19]。黄连、黄芩28个化学成分与5个CYP450亚酶进行网络互作分析。网络包含有效的化学成分和CYP450 2 类节点(node)。若CYP450为某化学成分的潜在作用靶点，则以边(edge)相连。

2 结果

2.1 黄连、黄芩化学成分

参照Lipinski 五规则，黄连、黄芩符合条件的化合物一共有28个，其中黄连和黄芩有1个相同的化学成分，黄芩19个化学成分，黄连9个化学成分。具体信息详见表2。

表2 黄连-黄芩化学成分

2.2 iGEMDOCK分子对接结果

iGEMDOCK结果以小分子和大分子匹配能量的多少决定结合的程度。如果匹配能量比较低，说明小分子和大分子结合的构象稳定。匹配能量比较高，说明结合的构象相对不稳定。将黄连、黄芩中28个化合物与CYP450酶的5个亚型进行能量匹配。结果显示：28个化合物与CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、 CYP2C9有较好的结合，与CYP3A4结合的没有阳性药谷胱甘肽构象稳定。对接结果见图1和表3。

图1 黄连、黄芩化学成分与CYP2D6对接结果

2.3 黄连、黄芩化学成分与CYP450亚酶的网络互作分析

黄连、黄芩28个化学成分，与CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4进行对接。阳性药谷胱甘肽与CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4对接能量分别为-121、-130、-132、-126、-142 kcal·mol-1。而N-乙酰半胱氨酸整体匹配能量都较高，说明构象不稳定。所以黄连-黄芩主要与阳性药谷胱甘肽进行比较。黄连、黄芩选择CYP1A2≤-121 kcal·mol-1，CYP2E1≤-130 kcal·mol-1，CYP2D6≤-132 kcal·mol-1，CYP2C9≤-126 kcal·mol-1，CYP3A4≤-142 kcal·mol-1进行小分子和大分子关联性分析。发现黄连、黄芩同时能与CYP1A2作用，黄连中的7个化学成分(Moupinamide，Palmatine，(R)-Canadine，Corchoroside A_qt，quercetin，Worenine，Epiberberine)与CYP1A2具有较低的结合能和较强的抑制作用，其中作用最强的是(R)-Canadine。黄芩中的4个化学成分(bis[(2S)-2- ethylhexyl]，5，7，4′-trihydroxy-8-methoxy flavanone，Epiberberine，NEOBAICALEIN)对CYP1A2有较强的抑制作用，其中作用最强的为NEOBAICALEIN。黄连、黄芩共有10个化学成分同时与CYP1A2结合，抑制其活性。其中Epiberberine为黄连、黄芩共有化学成分。同时黄连、黄芩共有3个成分同时与CYP2C9结合。黄芩中的3个化学成分与CYP2E1结合，2个化学成分与CYP2D6结合，而黄连与CYP2E1、CYP2D6的结合没有阳性药结合的稳定。黄连、黄芩通过与CYP450亚酶结合，黄连主要抑制CYP1A2和CYP2C9的活性，而黄连主要抑制CYP1A2、CYP2C9、 CYP2E1、 CYP2D6的活性。具体结果见图2。

表3 黄连-黄芩与CYP450亚酶对接得分

3 讨论

CYP2E1是一种I相毒物代谢酶，为代谢某些外源性和内源性化合物的重要酶系，是CYP450代谢酶家族中的重要一员。CYP1A2主要存在于人体的肝脏中，主要负责杂环胺类、芳香烃类和多数临床药物的代谢。CYP2E1和CYP1A2都具有破坏细胞结构、导致酶活性异常或失活、抑制基因表达甚至导致基因突变、加快细胞凋亡、导致机体疾病的发生或增加患病几率。很多药物的疗效或毒性与CYP1A2和CYP2E1酶的活性有关，所以CYP1A2和CYP2E1一直受到毒理、药理和药物致癌等多个研究领域的关注[20]。APAP在治疗剂量下，约5%～10%的APAP被CYP2E1、CYP3A4等代谢为具有肝毒性的N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)，与还原型谷胱甘肽结合，消除其毒性。因此，在治疗剂量下，APAP不会产生肝毒性。但是在大剂量服用时，特别是CYP2E1、CYP1A2等酶的诱导下，APAP产生的毒性代谢产物比较多，还原型谷胱甘肽无法全部消除，导致肝毒性。CYP2C9占CYP450蛋白总量的 15%～20%，在肝脏中表达，参与多种药物的代谢。CYP3A4是CYP3家族A亚家族发现的第四种酶，主要负责机体内50%以上的临床用药[19]。CYP2D6参与多种重要药物代谢，APAP在体内一部分也是通过CYP2D6进行代谢，但其高浓度时出现毒性作用[21]。因此可以通过抑制CYP450亚酶减弱APAP造成的肝损伤，减少毒性物质NAPQI的生成量。黄连、黄芩药理作用都具有保肝作用，同时又是清热解毒中药，临床应用广泛，副作用少，无毒。黄连、黄芩10个化学成分(Moupinamide，Palmatine，(R)-Canadine，Corchoroside A_qt，quercetin，Worenine，bis[(2S)-2-ethylhexyl]，NEOBAICALEIN，5，7，4′-trihydroxy-8-methoxyflavanone，Epiberberine)共同抑制CYP1A2的活性。3个化学成分共同抑制CYP2C9的活性。而且黄芩对CYP2E1、CYP2D6的活性也有影响。进一步表明黄连、黄芩配伍使用可能保肝效果更好。同时也发现CYP450酶系可能是黄连、黄芩降低药物性肝损伤的作用靶点，减少肝细胞损伤，从而达到保肝作用。