三种天然防腐剂对五种常见微生物抑菌作用的研究

冯林慧，李迎秋，张鑫

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 食品科学与工程学院，济南 250353)

食品加工和储藏过程中发生的食品腐败变质是目前食品工业面临的主要问题之一。化学防腐剂广泛地应用在食品工业中，从而有效地控制了食品中腐败微生物的生长。近年来，化学防腐剂的潜在毒性以及微生物耐药性的出现，使得人们越来越关注天然防腐剂的开发与研究[1]。天然防腐剂来源广泛，普遍存在于植物、动物、微生物中。天然防腐剂具有很多优点，如对高等动物正常细胞基本无毒副作用、水溶性良好、抗菌性好且不易产生耐药性[2]。

大豆球蛋白碱性多肽(植物来源)是从豆粕中提取出的一种阳离子肽，具有广谱抑菌性，且对人体胚胎肾细胞无毒性[3,4]。壳聚糖(动物来源)是甲壳素脱乙酰基后的一种碱性多糖，来源丰富，由于其良好的成膜性被应用于果蔬保鲜中[5]。乳酸链球菌素是(微生物来源)由乳酸链球菌产生的含34个氨基酸的一种多肽，是世界上公认的无毒副作用的天然食品防腐剂[6]。本实验选取李斯特菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色假丝酵母、黑曲霉，研究以上3种不同来源的天然防腐剂的抑菌活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

大豆球蛋白碱性多肽：实验室富集所得；壳聚糖：山东潍坊海之源生物有限公司；乳酸链球菌素：浙江银象生物工程有限公司；其余试剂：均为分析纯。

1.1.2 培养基及菌种

脑心浸液肉汤培养基(用于李斯特菌培养)、牛肉膏蛋白胨培养基(用于金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌培养)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(用于白色假丝酵母、黑曲霉培养)。李斯特菌ATCC 19115、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、绿脓杆菌ATCC 9027、白色假丝酵母ATCC 10231、黑曲霉菌ATCC 16404：齐鲁工业大学菌种保藏中心。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备

1.2.1.1 细菌和酵母菌菌悬液的制备

将细菌分别接种于脑心浸液肉汤琼脂斜面培养基和牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基，置于37 ℃下培养24 h；将酵母菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，置于37 ℃下培养60 h。然后挑取细菌和酵母菌菌落分别接种于脑心浸液肉汤液体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基，在37 ℃条件下恒温振荡培养过夜，平板计数测定菌体浓度，将培养液稀释成菌体浓度为107cfu/mL的菌悬液，4 ℃冰箱暂存备用。

1.2.1.2 霉菌孢子悬液的制备

将黑曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，28 ℃下培养60 h。然后用20 mL无菌水洗下孢子，涡旋振荡，调整孢子含量为107个/mL的菌悬液，4 ℃冰箱暂存备用。

1.2.2 防腐剂母液的配制

大豆球蛋白碱性多肽、壳聚糖、乳酸链球菌素用无菌水配制成质量浓度为30 mg/mL的溶液，无菌过滤，4 ℃保存备用。

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定

1.2.3.1 细菌和酵母菌最小抑菌浓度(MIC)的测定

将大豆球蛋白碱性多肽、壳聚糖、乳酸链球菌素的母液分别加入到细菌和酵母菌的菌悬液中，使3种防腐剂的终浓度为0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL，于37 ℃振荡培养24 h，用无菌水代替防腐剂作为阳性对照，用液体培养基代替菌液作为阴性对照，空白参比为阴性对照，在620 nm波长处测OD值。

1.2.3.2 霉菌最小抑菌浓度(MIC)的测定[7]

将马铃薯葡萄糖琼脂培养基和3种防腐剂均匀混合，使混合培养基中防腐剂的最终浓度为0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL，待温度降至50 ℃左右后，将混合培养基倒入无菌平板中，冷却。分别取100 μL孢子悬浮液注入马铃薯葡萄糖琼脂培养基表面，用无菌玻璃涂布棒涂布均匀，放置5 min，然后放入培养箱中，于28 ℃下倒置培养7天。用无菌水代替防腐剂作为阳性对照，每个浓度做3个平行，观察其生长状况，以肉眼看不到菌丝生长的最小防腐剂浓度作为最小抑菌浓度。

2 结果与讨论

2.1 大豆球蛋白碱性多肽最小抑菌浓度(MIC)的测定

大豆球蛋白碱性多肽对细菌和酵母菌的最小抑菌浓度见表1。

表1 大豆球蛋白碱性多肽对细菌和酵母菌的最小抑菌浓度

注：“-”表示无菌生长，“+”表示有菌生长。

大豆球蛋白碱性多肽对霉菌的最小抑菌浓度见图1。

图1 大豆球蛋白碱性多肽对霉菌的最小抑菌浓度

注：a为阳性对照，b为0.5 mg/mL，c为1.0 mg/mL，d为1.5 mg/mL，e为2.0 mg/mL，f为2.5 mg/mL。

本文选取的5种菌中，李斯特菌和金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌的代表，绿脓杆菌则为革兰氏阴性菌，白色假丝酵母为酵母菌，黑曲霉为霉菌。由表1和图1可知，大豆球蛋白碱性多肽对李斯特菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌3种细菌的最小抑菌浓度依次增大，分别为0.125，0.25，0.5 mg/mL；对白色假丝酵母的最小抑菌浓度为1.0 mg/mL，对黑曲霉的最小抑菌浓度为1.5 mg/mL。由此说明，大豆球蛋白碱性多肽对细菌有良好的抑菌作用，对革兰氏阳性菌的抑制作用尤其明显。这可能是由于绿脓杆菌作为革兰氏阴性菌具有脂多糖的双层膜比革兰氏阳性菌的单层膜对大豆球蛋白碱性多肽的耐受性好[8]。大豆球蛋白碱性多肽对酵母菌的抑制作用不明显，对霉菌的抑菌效果尤其微弱。

2.2 壳聚糖最小抑菌浓度(MIC)的测定

壳聚糖对细菌和酵母菌的最小抑菌浓度见表2。

表2 壳聚糖对细菌和酵母菌的最小抑菌浓度

注：“-”表示无菌生长，“+”表示有菌生长。

壳聚糖对霉菌的最小抑菌浓度见图2。

图2 壳聚糖对霉菌的最小抑菌浓度

注：a为阳性对照，b为0.5 mg/mL，c为1.0 mg/mL，d为1.5 mg/mL，e为2.0 mg/mL，f为2.5 mg/mL。

由表2和图2可知，壳聚糖对李斯特菌的最小抑菌浓度为0.5 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.25 mg/mL，对绿脓杆菌的最小抑菌浓度为0.5 mg/mL，对白色假丝酵母的最小抑菌浓度为2.0 mg/mL，对黑曲霉的最小抑菌浓度为2.0 mg/mL。壳聚糖对于金黄色的葡萄球菌的抑菌效果明显优于其他4种菌，对于酵母菌和霉菌的抑菌效果最差。

2.3 乳酸链球菌素最小抑菌浓度(MIC)的测定

乳酸链球菌素对细菌和酵母菌的最小抑菌浓度见表3。

表3 乳酸链球菌素对细菌和酵母菌的最小抑菌浓度

注：“-”表示无菌生长，“+”表示有菌生长。

乳酸链球菌素对霉菌的最小抑菌浓度见图3。

图3 乳酸链球菌素对霉菌的最小抑菌浓度

注：a为阳性对照，b为0.5 mg/mL，c为1.0 mg/mL，d为1.5 mg/mL，e为2.0 mg/mL，f为2.5 mg/mL。

由表3可知，乳酸链球菌素对李斯特菌和白色假丝酵母的最小抑菌浓度均为0.5 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.25 mg/mL，对绿脓杆菌的最小抑菌浓度为1.5 mg/mL。乳酸链球菌素同样对于金黄色葡萄球菌有非常好的抑制性，对于李斯特菌和白色假丝酵母的抑菌能力相对较差。绿脓杆菌的细胞壁组成致密，可以将分子质量为3500 D的乳酸链球菌素阻挡在胞外，因而乳酸链球菌素对绿脓杆菌的抑菌效果微乎其微[9]。由图3可知，乳酸链球菌素对黑曲霉无抑菌效果，这与张旋等[10]的研究结果一致。

3 结论

实验结果表明，大豆球蛋白碱性多肽、壳聚糖、乳酸链球菌素对于金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.25 mg/mL，说明3种天然防腐剂对于金黄色葡萄球菌均有较强的抑菌作用。大豆球蛋白碱性多肽对李斯特菌的抑制效果最佳，最小抑菌浓度为0.125 mg/mL；其他2种防腐剂对李斯特菌的抑制效果稍差，最小抑菌浓度都是0.5 mg/mL。大豆球蛋白碱性多肽和壳聚糖对绿脓杆菌的最小抑菌浓度均为0.5 mg/mL，对白色假丝酵母的最小抑菌浓度分别为1，2 mg/mL，对黑曲霉的最小抑菌浓度分别为1.5，2.0 mg/mL。乳酸链球菌素与其他2种防腐剂相比，对黑曲霉没有抑菌效果；对绿脓杆菌的抑制效果最不理想，最小抑菌浓度为1.5 mg/mL；而对于白色假丝酵母的抑菌性最好，最小抑菌浓度为0.5 mg/mL。本实验证明了3种天然防腐剂具有良好的抑菌效果，但同时发现单一防腐剂使用的局限性，因此天然防腐剂的复合使用将是食品工业中一大热点。