过氧化氢诱导人肝癌细胞BEL7402产生氧化应激细胞模型的建立

文丽梅，卢帅，吕国栋，李亚芬，郑璇，田春艳，赵军，王建华

氧化应激(oxidative stress，OS)，最早是在1985年由Park等[1]提出。正常情况下，机体内氧化与抗氧化系统处于动态平衡状态，但是在遭受到有害刺激时，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量生成，超过了机体抗氧化系统的清除能力，致使ROS的产生与清除失衡，就会导致氧化应激[2]。近年来，有研究发现阿尔茨海默病[3]、糖尿病、高血压或其他心血管疾病[4-5]、癌症等许多疾病都与氧化应激有关。过氧化氢(H2O2)是一种很强的氧化剂，可诱导机体产生大量的ROS，导致机体的氧化应激反应，造成机体氧化损伤。ROS的大量积聚广泛攻击体内生物大分子，被攻击的蛋白质、脂类可经降解，再重新合成，但核酸分子损伤后一般不被降解而直接修复，未被修复的损伤DNA片段可积累下来，造成进一步更大的损害。有报道称几乎所有氧化应激状态都有H2O2产生，它还能够穿透细胞膜，而且易于取得，性质稳定[6]。因此，H2O2已成为建立体外氧化损伤模型的重要工具[7-8]。本研究以H2O2为诱导剂，以人肝癌细胞BEL7402为基础，通过测定细胞存活率、ROS含量、DNA损伤状况、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，探索得到最佳H2O2浓度及干预时间，从而构建体外氧化应激模型，为进一步研究抗肝癌药物的氧化应激机制奠定了基础。

1 材料与方法

本研究起止时间为2017年3月至11月。

1.1试剂与材料BEL7402购自协和医科大学；噻唑蓝(MTT，美国Biosharp公司，生产批号2016/12)；碘化丙啶(生物染色剂级，纯度≥95%，生产批号P-4170)和琼脂糖(生物技术级，纯度≥98%，生产批号9012-36-6)均购自美国Sigma公司；胰蛋白酶(生产批号1665788)、胎牛血清(FBS，生产批号1205331)和RPMI 1640培养基(生产批号8116524)均购自美国Gibco公司；青链霉素(双抗，美国Hyclone公司，生产批号J160035)；二甲基亚砜(DMSO，生产批号#2035C358)、低熔点琼脂糖(生物技术级，生产批号0815)和乙二胺四乙酸(EDTA，分析纯，生产批号6381-92-6)均购自美国Amresco公司；H2O2(医用级别，陕西欣通化工公司，生产批号20160526)；PBS缓冲液(北京索莱宝公司，生产批号20160829)；丙二醛试剂盒(MDA，生产批号20160707)、超氧化物歧化酶试剂盒(SOD，生产批号20160707)和谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(GSH-Px，生产批号20160708)均购自南京建成生物工程研究所；测定与分析用水均为超纯水。

1.2仪器SW-CJ-IFD型超净工作台(苏州净化设备有限公司)；MLS-3750高压蒸汽灭菌器(日本SANYO公司)；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)；IX73荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；SORVALL LEGEND RT+冷冻离心机(美国Thermo公司)；37 ℃恒温CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；Varioskan Flash全波长扫描式多功能酶标仪(美国Thermo公司)；Mupid-2plus电泳仪(日本MUPID公司)；PSY-2220数显恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1BEL7402培养[9]将BEL7402细胞培养于CO2恒温(37 ℃)饱和湿度的培养箱中，培养液为含有10%胎牛血清，2%青链霉素的RPMI1640培养基，每2～3 d换培养液，消化采用0.25%的胰蛋白酶(含0.02%的EDTA)，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3.2分组及处理 实验共设4组，分别为健康对照组、10 μmol/L H2O2组、100 μmol/L H2O2组和1 000 μmol/L H2O2组，每组做3个平行副孔。

1.3.3细胞存活率测定 用MTT法检测细胞存活率[10]，取对数生长期的BEL7402细胞，按105个/mL接种至96孔板，培养24 h后，弃去上清，健康对照组加200 μL培养基，H2O2处理组分别加等体积的终浓度为10、100和1 000 μmol/L的H2O2的培养基溶液，每组做3个平行副孔。分别继续培养0、2、4、6、8、10、12和24 h，每孔再加入0.01 mL 5 mg/mL的MTT，继续孵育4 h后，吸去上清液，每孔加0.2 mL的DMSO，震荡5 min，用酶标仪对各孔在波长570 nm处吸光度值进行检测。

1.3.4细胞DNA损伤测定[11]采用单细胞凝胶电泳技术来检测细胞DNA的损伤情况(彗星实验)，取对数生长期的BEL7402细胞，按105个/mL接种于96孔板上，设为4组，每组3个平行副孔。培养24 h，吸去培养液，采用上述加药物方法处理4 h，吸去培养液，用4℃预冷的PBS洗1次，加入0.25 %胰蛋白酶进行消化后，离心机1 000 r/min离心5 min，收集细胞，再用PBS重悬。将载玻片浸入0.6 %的正常熔点琼脂糖中，对载玻片进行干烤过夜(65 ℃)，待用。取0.1 mL单细胞悬浮液，离心，沉淀用100 μL 0.75 %的低密度琼脂糖混匀，铺于第一层胶上，盖上盖玻片，4 ℃放置5 min，使其凝固后移去盖玻片。将胶板浸入4 ℃新配置的细胞裂解液(0.1 mol/L Na2EDTA、2.5 mol/L NaCl、0.01 mol/L三羟甲基氨基甲烷 (trihydroxymethyl aminomethane，Tris)，NaOH调pH至10.0，临用前根据用量按总体积加1 % Triton-X-100，10 % DMSO混匀)中1.5 h，溶解细胞膜和核膜。取出载玻片，用PBS轻柔冲洗2次，以去掉载玻片表面高浓度的盐，然后将胶板浸入4 ℃水平电泳槽(碱性电泳缓冲液为：0.001 mol/L Na2EDTA、0.3 mol/L NaOH，pH 13.0，现配现用)中，缓冲液约覆过胶面0.25 cm。碱解旋20 min，电泳(20 V，200 mA)20 min。电泳完毕后，滤纸吸干载玻片电泳缓冲液，再用Tris-HCl(pH 7.5)中和15 min。最后用50 μg/mL的PI染液避光染色15 min，蒸馏水脱色5 min，用荧光显微镜进行观察[12]并拍照。用CASP软件对图片中采用等距随机抽样法选取的20个细胞进行尾距(olive tail moment，OTM)的测定(尾部DNA的百分比与头、尾中心间距的乘积)。

1.3.5活性氧含量测定[13]双氢罗丹明123(DHR123)作为一种荧光探针本身无荧光，但能够进入大多数细胞，被氧化成的荧光产物罗丹明123大量聚集在线粒体膜上，即被广泛用来检测活性氧自由基含量的变化。实验分为4组，即正常组、10、100、1 000 μmol/L H2O2药物处理组。先向长满细胞的孔板中加入终浓度为2×10-6mol/L的DHR123，放置在37 ℃恒温培养箱中孵育，采用全波长扫描式多功能酶标仪读数，动态读取荧光值120 min，每10分钟1次。

1.3.6MDA、SOD、GSH-Px测定 采用上述加药物方法处理BEL7402细胞4 h后，用无菌PBS洗3遍，用0.25 %的胰蛋白酶(含0.02 %的EDTA)消化，制成细胞悬浮液，4 000 r/min，离心5 min，收集细胞，用1 mLPBS洗1遍，然后加细胞裂解液(150 mmol/L NaCl、150 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、1 % Triton X-100，pH 8.0)裂解细胞，低温(4 ℃)离心1 h，收集上清液，参照南京建成生物工程研究所提供的相应试剂盒说明书，检测细胞内MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

2 结果

2.1不同浓度H2O2处理对BEL7402存活率影响不同浓度的H2O2处理BEL7402细胞0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h后，对其存活率进行检测，统计结果(χ2=52.94，P<0.01)如图1所示：高浓度的H2O2(1 000 μmol/L)抑制BEL7402细胞存活率，而低浓度的H2O2(10和100 μmol/L)则是先抑制增长后刺激增长。100 μmol/L H2O2处理BEL7402细胞4 h后，其存活率为(43.44±5.74)%，与10 μmol/L处理组(92.77±5.51)%相比，细胞存活率显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 不同浓度H2O2对BEL7402细胞活性的影响(n=3)

2.2不同浓度H2O2处理对BEL7402细胞ROS含量的影响采用不同浓度的H2O2处理BEL7402 细胞120 min内活性氧含量如图2所示：100 μmol/L H2O2组BEL7402细胞体内的活性氧含量在40 min时达到峰值，之后呈下降趋势；而10 μmol/L H2O2组BEL7402体内的活性氧含量始终处于较低水平；1 000 μmol/L H2O2组BEL7402体内的活性氧含量在40 min之后低于正常组，这可能与BEL7402细胞不能耐受1 000 μmol/L H2O2，细胞存活率下降，从而导致活性氧含量急剧下降，以致低于健康对照组。

图2 不同浓度H2O2对BEL7402细胞内ROS含量的影响(n=3)

2.3不同浓度H2O2处理对BEL7402细胞DNA损伤影响不同浓度H2O2处理BEL7402细胞4 h后单细胞凝胶电泳实验见图3。各组Olive尾距(OTM值)统计结果(F=16.25，P<0.01)见表1。与健康对照组比较，10 μmol/L H2O2组OTM值差异无统计学意义(P>0.05)，100 μmol/L H2O2组OTM值升高(P<0.05)，1 000 μmol/L H2O2组OTM值升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

图3 彗星实验检测H2O2诱导的BEL7402细胞DNA损伤：A为健康对照组；B为10 μmol/L H2O2组；C为100 μmol/L H2O2组；D为1 000 μmol/L H2O2组

组别细胞数尾距/(μm,x±s)健康对照组200.12±0.2210 μmol/L H2O2组200.23±0.15100 μmol/L H2O2组207.04±2.84a1 000 μmol/L H2O2组2016.57±5.21b

注：与健康对照组相比，aP<0.05，bP<0.01

2.4不同浓度H2O2处理对BEL7402细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活性影响浓度不同的H2O2作用于BEL7402细胞4 h后MDA含量(F=441.92，P<0.01)、SOD活性(F=713.99，P<0.01)及GSH-Px活性(F=46.578，P<0.01)结果如表2所示：与健康对照组相比，10 μmol/L的H2O2作用于细胞，MDA含量升高(P<0.05)；100 μmol/L H2O2处理细胞后，MDA含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性下降(P<0.05或P<0.01)；1 000 μmol/L H2O2处理细胞后，MDA含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性下降，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 不同浓度H2O2处理(平行副孔数=5)对BEL7402

注：与健康对照组相比，aP<0.05，bP<0.01

3 讨论

在人体中，肝脏是进行代谢的主要脏器，也是外源性毒物和药物等代谢的主要器官，因此也是体内发生氧化应激的中心部位。肝癌是恶性肿瘤中发病率较高的一种，严重威胁着人民的生命健康。目前有研究表明[14]，一方面氧化应激或脂质过氧化造成的DNA氧化损伤是肿瘤发生的重要致病机理，另一方面肿瘤细胞对氧化应激的敏感性高于正常细胞。1974年，从临床肝癌手术标本中成功提取培养的BEL7402细胞株，与临床肝癌细胞相似。Roshan[15]指出吉马酮可以浓度依赖性的提高活性氧浓度并促进细胞凋亡。MDA是脂质过氧化产物，通过MDA含量反映脂质过氧化程度，SOD、GSH是机体主要抗氧化酶，二者水平是反映机体抗氧化能力的重要指标[16]。因此本研究对于研究氧化应激类的肝病，如肝癌、脂肪肝、各种因素导致的肝炎等的发病机理、药物的临床应用都有重要的意义。

H2O2易得，性质稳定，易透过细胞膜，生成活性氧自由基，用H2O2诱导的氧化应激模型，应用最为广泛[17]。同时，也是细胞内最丰富的活性氧簇ROS之一，参与调节新陈代谢、凋亡和生长因子等相关的信号通路。尽管其本身会迅速与信号分子反应而失活，但其造成级联反应能导致氧化应激持续存在，使其成为氧化应激研究的重要工具药。但是，H2O2的最终浓度及处理时间所造成的肿瘤细胞BEL7402的氧化应激状态仍不明确，其具体机制仍有待阐明，因此，探讨H2O2诱导的氧化应激模型中，动态监测BEL7402细胞系的应激反应必将对研究氧化应激相关疾病的发生机制和预防提供新的思路。

不同浓度的H2O2对细胞存在双向性作用：在H2O2浓度作用不同时间后发现高浓度H2O2(1 000 μmol/L)抑制BEL7402细胞存活率，而低浓度的H2O2(10和100 μmol/L)则是先抑制增长后刺激增长。因此可以说明在氧化应激状态下，由于细胞对H2O2的削减作用不同，可能影响实验结果。肝癌细胞在氧化应激环境中存在双向反应。另外，我们采用4 h的药物处理时间，浓度为100 μmol/L的H2O2作用于BEL7402细胞，彗星实验效果明显，其细胞尾部明显增长，而且SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，变化明显。推测4 h为最佳作用时间，而100 μmol/L为最佳H2O2浓度。除此之外，100 μmol/L H2O2可使BEL7402细胞内的活性氧含量在40 min时升到峰值，且在药物处理的120 min内，其ROS含量始终高于正常组的ROS含量，说明其既可升高BEL7402细胞内的ROS含量，且使其保持存活状态，模拟了体内氧化应激反应。

综上所述，浓度为100 μmol/L的H2O2作用BEL7402细胞4 h，可成功构建以H2O2为氧化应激诱导剂的BEL7402细胞体外氧化应激模型。ROS引发的氧化应激是多种肝病的共同病理生理基础。人肝癌细胞株BEL7402与肝细胞具有相似的生物学活性，因此BEL7402细胞氧化应激模型的建立为揭示氧化应激机制以及研究和筛选可能通过氧化应激机制发挥抗肝病作用的新药研发奠定基础。