猪流行性腹泻病毒CH-HeNXX-2017株全基因组序列测定与分析

焦文强 ，许 峰 ，徐引弟 ，王治方 ，张青娴 ，王克领 ，朱文豪 ，李海利 ，张立宪 ，郎利敏

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州450002）

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus），核酸类型为单股正链RNA。猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由PEDV感染猪引起的一种高度接触性肠道传染性疾病，临床以呕吐、腹泻和脱水为主要特征。该病对各种年龄阶段的猪均易感，尤其是7日龄以内的哺乳仔猪，发病后死亡率可达100%。1971年英国首次报道PED的流行[1]，随后迅速蔓延到欧洲其他国家，并在比利时流行期间被证实其病原为PEDV，给欧洲养猪业带来了重大损失[2-3]。在亚洲，日本、韩国、泰国以及越南都曾报道过PED的流行[4-6]。我国于1984年首次报道PEDV在我国猪场的存在，并且在2010年以前主要以零星出现为主[7]，但是从2010年10月开始，我国南方较多省份暴发了PED，并迅速蔓延到全国多个省份和地区，测序证明，本次PED暴发是由变异的PEDV引起。

2017年10月至2018年2月，豫北某免疫过猪流行性腹泻疫苗的规模化猪场产房2日龄仔猪突然发生水样腹泻、呕吐，迅速脱水死亡，且传播迅速，发病率为80%，死亡率达到90%，剖检病例变化主要表现为肠壁变薄，肠黏膜脱落，胃内有大量固体状奶块。通过临床症状和病例变化分析，初步怀疑为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与细菌混合感染引起的消化道综合征。通过临床诊断和实验室诊断，最终确定为猪流行性腹泻病毒感染。

本研究对CH-HeNXX-2017毒株进行了全基因组序列测定，旨在分析该毒株与疫苗毒株在基因序列和抗原性等方面的差异，为以后PEDV疫苗毒株的筛选提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 无菌采集濒死的仔猪的肠道组织，加入1 mL灭菌PBS，在研钵中充分研磨后倒入1.5 mL离心管中，8 000 r/min离心5 min，取上清置-80℃冰箱备用。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂盒、MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、pMD20-T载体、JM109感受态细胞、T4DNA连接酶、DL 2000 Marker、核酸染料、DNA胶回收试剂盒、小型质粒提取试剂盒，均购自于宝日医生物技术（北京）有限公司；琼脂糖购自于Invitrogen公司；DMEM培养基和胰酶购自于北京索莱宝生物科技有限公司，胎牛血清购自于Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的检测 取-80℃冻存的组织上清液，按照RNA提取说明书进行RNA抽提。抽提的RNA立即用于反转录反应，体系如下：5×MLV缓冲液 2 μL，dNTP 2 μL，MLV 反转录酶 0.5 μL，RNA酶抑制剂0.3 μL，特异性检测引物0.3 μL，加入RNA 4.9 μL，共 10 μL，充分混匀后置 42 ℃水浴1 h，然后70℃反应10 min后进行PCR反应。PCR反应体系为：cDNA1 μL，上、下游引物各 1 μL，10×Taq Buffer 5 μL，dNTP 8 μL，Taq DNA聚合酶 1 μL，灭菌双蒸水补足50 μL。引物参照文献[8]，并进行少许优化。

PCR反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35 个循环；72℃延伸10 min。PCR反应结束后，取5 μLPCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳检测，回收与预期大小相符的片段，连接pMD19-TSimple载体，4℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，37℃培养15 h后挑取单克隆进行PCR检测，阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.2 猪流行性腹泻病毒的分离 将生长状态良好的Vero细胞弃去培养液，用无菌的PBS冲洗细胞2次，然后将病料上清加入到细胞中，加胰酶至终质量浓度5～6 μg/mL，37℃5%CO2培养箱培养2 h，每隔15 min晃动一下细胞，以确保病料上清与细胞充分结合[9-10]。2 h后弃去培养液，加入终质量浓度为5～6 μg/mL的胰酶，37℃连续培养96 h，并连续盲传5代，待观察到有细胞病变时收获病毒液。

1.2.3 PEDV CH-HeNXX-2017株基因组全长的扩增 参照文献[11]设计的引物进行全基因组序列的扩增。引物序列参照表1。具体的反转录以及PCR扩增体系和反应程序同1.2.1。

表1 PEDV CH-HeNXX-2017株全序列扩增引物

续表1

1.2.4 PEDV CH-HeNXX-2017株遗传进化分析将本研究得到的PEDV CH-HeNXX-2017株全长基因组序列与GenBank中下载的国内外参考毒株进行比对，应用MEGA5.0软件进行遗传进化分析，采用Neighbor-Joining算法生成系统进化树。

2 结果与分析

2.1 猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒（TGE）和猪轮状病毒（RV）的RT-PCR检测

按照本研究设计的引物，可以扩增出约500 bp的片段，而猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒则没有目的条带出现（图1）。根据此结果判断，猪流行性腹泻病毒阳性，猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒阴性。

2.2 猪流行性腹泻病毒的分离

从图2可以看出，用病毒上清接种Vero细胞盲传5代以后，发现细胞出现变圆、肿胀等形态变化，最后发现多核体特征性病变（2-A），确定为病毒分离成功。

2.3 PEDV CH-HeNXX-2017株基因组全长的扩增

采用本研究中的引物，将PEDV CH-HeNXX-2017分为19段进行扩增，然后通过片段之间的重叠部分将整个基因组全长拼接起来（图3，4）。

2.4 PEDV CH-HeNXX-2017株遗传进化分析

通过进化树分析，本研究得到的CH-HeNXX-2017株（图5中的三角标记）与传统毒株如CV777，LZC，DR13等亲缘关系较远，而与新近分离的毒株如IA1，USA Colorado 2013，MN和PC22A等在同一个进化分枝中，亲缘关系较为接近（图5）。

3 讨论

1984年，我国成功分离出第1株PEDV毒株，证明了PEDV在我国的存在。但是直到2010年以前，PEDV在我国主要呈现地方零星出现的特点，很少出现大范围的流行。2010年开始，我国大部分省份都经历了一次PEDV疫情，给养猪业健康发展带来了巨大的经济损失[12]。

本研究得到的CH-HeNXX-2017全基因组序列，分离自豫北某规模化猪场，该场一直对母猪进行PEDV免疫，且未见大范围仔猪腹泻的发生，但是这次突发产房仔猪腹泻，临床症状表现为水样腹泻，迅速脱水死亡。经过临床诊断和剖检病理变化，并结合实验室检测，最终确定为是由PEDV感染所致。说明PEDV病毒可能已经发生了变异，抗原性和免疫原性已经发生较大变化，接种现有的疫苗不能完全中和病毒的繁殖。为了进一步分析此次疫情毒株的遗传进化情况，通过全基因组序列构建的系统进化树分析发现发现，本研究得到的CH-HeNXX-2017 与 IA1，USA Colorado 2013，MN 和 PC22A 等毒株在同一个进化分析中，亲缘关系较为接近，而与传统毒株CV777和LZC等毒株亲缘关系较远，与赵丽等[13-14]的研究结果一致。其原因主要是因为RNA病毒在自身基因组复制过程中缺少5′-3′DNA聚合酶的校正功能，加之PEDV与野毒株之间不断进行重组、突变和缺失，造成了PEDV一直处于不断进化变异中。因此，对病毒进行长期的遗传进化分析，对于临床诊断和疫苗研发等具有重要意义。另外，PEDV对于肠道组织具有明显的嗜性，除了常规的细胞免疫和体液免疫以外，黏膜免疫也具有重要的抗病毒作用。目前，我国使用的PEDV疫苗多为全病毒灭活苗，且多为肌肉注射，这样并不能完全激活黏膜免疫在抗PEDV的作用[15]。因此，对于PEDV疫苗的研发需要考虑多种因素，在PEDV防控和疫苗研发方面还面临着巨大的挑战。