杂交狼尾草腋芽的离体培养与组培快繁技术

苏 艳 ，杨宝明 ，黄玉玲 ，李永平 ，王丽花 ，龙 媛 ，张艺萍

（1.云南省农业科学院花卉研究所，农业部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明），国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明650205；2.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南昆明650205；3.屏边县新华乡农业技术推广站，云南屏边661205）

杂交狼尾草（Pennisetum americanum×Pennisetum.purpeum）是以二倍体美洲狼尾草和四倍体象草交配产生的三倍体杂种，其属热带植物，广泛分布于热带和亚热带南部地区，具有较强的抗倒伏、抗病、抗旱和保水能力，又具有一定的耐湿和耐盐能力，产量高，耐收割，供青时间长[1-3]；蛋白质含量高，适应地区广，是适合饲喂牛、羊、鱼等多种草食畜禽的优质青饲料作物[4-5]。然而，杂交狼尾草不耐寒，不能自然越冬，只能作1年生栽培，而且种子不育，只能用根或茎秆进行无性繁殖，但根和茎秆数量有限，种苗的供给问题严重制约了杂交狼尾草在我国寒冷地区的推广应用[1-4]。

本试验以杂交狼尾草茎节处的饱满腋芽为繁殖材料，通过诱导腋芽、继代增殖培养以及生根壮苗3个步骤进行试验研究，旨在以简单、有效的方法，探索快速培育杂交狼尾草优良种苗的方法[6-25]，以促进杂交狼尾草的进一步开发和利用，为杂交狼尾草的组培产业化生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料是于2017年6月采自贵州毕节市大田种植的杂交狼尾草茎秆。

1.2 方法

1.2.1 外植体选择 选择生长健壮、长势良好、分蘖多、产量高、无病虫害、当年生中上部幼嫩茎秆作为外植体。

1.2.2 外植体处理 选取叶鞘包裹紧实、距顶端4～5节的茎段，保留叶鞘，去除叶片，并用肥皂水刷冼干净，然后用自来水冲洗2～3 h。

1.2.3 外植体灭菌 剥除叶鞘，选择腋芽饱满的茎节，以茎节为中心，两端各留1 cm切取茎节。在无菌工作台内用质量分数为0.1%的HgCl溶液浸泡15 min，无菌水冲洗5～6次，再用无菌滤纸吸干表面水分，备用。

1.2.4 培养基及培养条件 以MS＋庶糖30 g/L＋琼脂粉5 g/L为基本培养基，pH值5.8～6.0。

诱导培养基为：（1）MS＋KT 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（2）MS＋KT1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（3）MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（4）MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA0.2 mg/L；（5）MS＋KT2.0 mg/L＋NAA 0.4 mg/L；（6）MS＋6-BA2.0 mg/L＋NAA0.4 mg/L。

增殖培养基为：（7）MS＋KT 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（8）MS＋KT 2.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（9）MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA0.1 mg/L；（10）MS＋6-BA 2.5 mg/L＋NAA0.1 mg/L；（11）MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（12）MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L；（13）MS＋6-BA3.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L；（14）MS＋6-BA4.0 mg/L＋NAA0.3 mg/L。

生根培养基为：（15）MS＋NAA 0.2 mg/L；（16）MS＋NAA 0.4 mg/L；（17）MS＋IBA 0.5 mg/L；（18）MS＋IBA0.2 mg/L；（19）MS＋IBA0.4 mg/L；（20）MS＋IBA0.5 mg/L。

以上各阶段，培养温度为（25±2）℃，光照时间为12 h/d，光照强度为1 600～2 000 lx。

1.2.5 外植体腋芽诱导培养 将无菌腋芽从茎节处切下（带部分茎节组织，不要损伤腋芽），接种于外植体诱导培养基（1）～（6）中进行培养，25 d时观察统计结果。

1.2.6 芽丛增殖培养 将诱导培养所得芽丛，按1～2个芽为一丛进行分割后，接种到丛生芽增殖培养基（7）～（14）中进行培养。每处理接种9瓶，每瓶接种5丛，25 d时观察统计结果。

1.2.7 生根壮苗培养 选择丛生芽中生长健壮、长势良好、高度达3 cm左右的小苗，从其基部切成单芽，接种到生根培养基（15）～（20）中进行培养。每处理接种12瓶，每瓶接种10株，15 d时统计生根情况。

1.3 数据处理

采用SPSS统计分析软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对杂交狼尾草外植体腋芽诱导的影响

由表1可知，将外植体接种到诱导培养基6 d后，可观察到（6）号培养基中的部分腋芽开始萌动，（1）～（5）号培养基接种8 d后部分腋芽才开始萌动，（1）～（6）号培养基都能诱导腋芽萌发。从总体情况看，不定芽的分化效果随着6-BA，KT以及NAA质量浓度的增加，芽的萌动时间缩短，芽的分化数量随之增加，6-BA的诱导效果好于KT。当6-BA质量浓度为2.0 mg/L，NAA质量浓度为0.4 mg/L时，腋芽萌动最早、芽分化数量最多，每个腋芽平均产生丛生芽3.53个。因此，MS＋6-BA2.0 mg/L＋NAA 0.4 mg/L是最适合杂交狼尾草腋芽诱导的培养基。

表1 不同激素和质量浓度对杂交狼尾草外植体腋芽诱导的影响

2.2 不同培养基对杂交狼尾草不定芽增殖的影响

由表2可知，在继代增殖培养过程中，不同质量浓度的6-BA，KT与不同质量浓度的NAA配合使用对芽增殖的效果有所不同。其中，6-BA和KT都能促进芽增殖，并随着6-BA和KT质量浓度的增加芽的分化数量增加。从整体上看，在相同质量浓度下，6-BA促进芽分化的效果明显好于KT，更有利于芽的增殖。当6-BA质量浓度达到4 mg/L时，芽的分化数量反而减少，芽丛不生长，芽的高度下降，说明高质量浓度的6-BA会抑制芽的生长；另外，NAA质量浓度太低不利于芽的分化和伸长。当6-BA质量浓度为2～3 mg/L，NAA质量浓度为0.3 mg/L时，芽的增殖数量最多，生长速度最快，芽整齐、粗壮。因此，增殖培养基以MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA0.3 mg/L为最佳。

表2 不同培养基对杂交狼尾草不定芽增殖分化的影响

2.3 不同培养基对杂交狼尾草苗生根的影响

由表3可知，在培养基中添加NAA或IBA都能诱导生根，不同处理对不定根的诱导能力不同。其中，（17号）和（20号）2个培养基，生根效果最好，生根率均为100%。添加NAA的培养基生根相对较快，接种10 d后开始产生根原基，15 d左右开始有根系长出，根系粗、多、整齐，但根短、脆；添加IBA的培养基生根相对要慢，根原基不明显，18 d左右才开始生根，根系相对较少、整齐度较差，但根系粗细适中、柔软。从驯化炼苗成活率考虑，生根培养基以MS＋IBA0.5 mg/L为最佳。

表3 不同培养基对杂交狼尾草芽生根的影响

3 结论与讨论

本试验以杂交狼尾草植株中上部茎节（带饱满腋芽）为外植体，易灭菌、接种污染率、褐化率低；直接诱导腋芽分化，诱导时间短，芽萌动早，生长快，较易获得无菌繁殖体系。激素的种类、浓度和组合是影响外植体诱导和植株再生的关键因素，本试验结果表明，无论是外植体的诱导或芽丛的增殖，6-BA和NAA组合的效果好于6-BA和IBA，过高或过低的质量浓度的6-BA和NAA都不利于腋芽的诱导和丛生芽的增殖，6-BA的质量浓度为2～3 mg/L，NAA质量浓度为0.2～0.4 mg/L时有利于芽的增殖。当6-BA质量浓度为4 mg/L对芽的生长有抑制作用，芽多但生长较慢。另外，通过本试验还发现，杂交狼尾草在增殖培养过程中极易发生褐化，随着培养时间的延长，褐化情况会明显加重，在20～25 d的生长周期内进行转接，并在培养基中加入活性炭（0.5 g/L），可减轻褐化现象的发生。说明适时转接并在培养基中添加活性炭对抑制褐化现象十分重要。