马铃薯不同起始外植体不定根快速诱导体系的建立

张紫娟 ，侯雷平 ，薛红卫 ，许智宏 ，4，朱木兰 2，

（1.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；2.中国科学院上海辰山植物科学研究中心，上海辰山植物园，上海201602；3.中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海200032；4.北京大学现代农学院，北京100080）

油菜素内酯（Brassinolide，BL）又名芸苔素内酯，是一种新型植物内源激素，在国际上已被列为第六大类植物激素[1]。20世纪70年代初，美国科学家MITCHELL等[2]首次从油菜花粉中分离出了对植物生长具有调节功能的生理活性物质，将其命名为油菜素（Brassins）。1979年，GROVE 等[3]分离出油菜素，并鉴定了其分子立体结构，确认该物质为一种甾醇类化合物，并正式将其命名为油菜素内酯。目前，在植物界已发现了60多种油菜素内酯类化合物，统称为油菜素内酯化合物（Brassinosteroids，BRs）[4]。

作为一种类固醇类激素，油菜素内酯在植物生长发育过程中起着不可忽视的作用，它能促进细胞伸长，影响细胞的分裂分化，促进植物进入生殖生长，影响花诱导及分化，同时还能提高植物对逆境条件的抵御能力[5]。而2，4-表油菜素内酯（2，4-epibrassinolide,EBR）是其中用途较广泛、使用较多的一种[6]，且近年来对它的研究越来越多，如在种子萌发、幼苗生长等方面，而在农作物离体再生方面的应用效果鲜见报道。

马铃薯（Solanum tuberosum L.）属双子叶植物纲茄科茄属，1年生草本植物，是一种粮菜兼用作物，具有产量高、适应性强、分布范围广等特点；又是很多加工产品的原材料，用途广泛，产业链长，在农业生产以及人民生活中具有不可替代的作用[7]。自2016年马铃薯被作为主粮产品进行产业化开发后，其栽培面积更加广泛，产业规模大幅提高，马铃薯种苗市场的需求量显著增加[8]。因此，急需马铃薯高产优质的种苗生产方法。

离体再生技术为马铃薯的种质资源创新、种苗脱毒快速繁殖、工厂化育苗提供了有效途径。因此，在马铃薯物种上应用离体再生技术时，缩短马铃薯离体再生过程中的滞瓶期，加快工厂化出苗进程尤为重要。

本研究以马铃薯品种大西洋无菌试管苗为试材，以2，4-表油菜素内酯为主导植物生长调节剂，对马铃薯不同起始外植体不定根快速诱导的最佳体系进行了筛选，以期为日后马铃薯离体再生的相关研究以及工厂化育苗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为上海辰山植物科学研究中心遗传转化平台储备提供的马铃薯品种大西洋的无菌苗。

1.2 基本培养基与培养条件

以MS为基本培养基，添加30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂粉，pH值调至5.80；所有培养基均经121℃灭菌17 min，植物激素经过滤灭菌后添加到受试培养基中。培养条件为光照强度1 500～2 500 lx，光照时长 16 h/d，温度（23±1）℃。

1.3 试验方法

选取长势良好的幼苗（2.0～3.0 cm）、茎段（1.0～1.5 cm，带腋芽芽点）、叶片（带叶柄）接种至含有不同质量浓度 EBR（0，0.01，0.05，0.1，0.5，1.0 mg/L)和NAA（0，0.1 mg/L）的MS培养基上，并进行多次重复试验。

1.3.1 幼苗 每瓶接种3～5个，记录生根启动天数、平均生根天数（即当根满足根条数＞5条、根长度＞4 cm时的天数），10 d后统计生根频率以及幼苗的平均不定根数。

1.3.2 茎段 每培养皿接种10个，记录生根启动天数，10 d后统计生根频率以及不定芽诱导率。

1.3.3 叶片 每培养皿接种10个，记录生根启动天数，15 d后统计生根频率。

1.4 数据统计

数据统计分析采用Microsoft Excel 2013和IBM SPSSStatistics Version 20软件进行。

2 结果与分析

2.1 大西洋马铃薯幼苗的不定根离体发生情况

将长势良好的幼苗转接至不定根离体诱导的培养基中3～7 d后，幼苗陆续出现不定根。从表1可以看出，与不添加植物生长调节剂的处理相比，只添加0.1 mg/L NAA和只添加0.01 mg/L EBR的处理，启动时间和平均生根天数均较短，生根频率和平均不定根数均有所增加，且只添加0.1 mg/L NAA的处理效果更明显（图1-A，B，C）。当NAA质量浓度为0.1 mg/L时，随着EBR质量浓度的升高，不定根发生的启动天数逐渐减少，平均生根天数先减少后增加、生根频率以及平均不定根数先升高后下降。当EBR质量浓度为0.01 mg/L，NAA质量浓度为0.1 mg/L时，幼苗不定根诱导效果最佳，启动时间约为4 d左右，平均生根天数约10 d，生根频率可达99.39%，幼苗平均不定根数为11.93条，根较健壮，根系较发达，有利于提高后续的移栽存活率（图1-D）。EBR质量浓度为0.05 mg/L，NAA质量浓度为0.1mg/L的处理，与EBR质量浓度为0.01mg/L，NAA质量浓度为0.1 mg/L的处理相比，启动时间和平均生根天数相近，差别不大，生根频率和幼苗平均不定根数略低，但其根系有大量侧根发生，可增加移栽后与土壤的接触面积，提高移栽成活率（图1-E）。而当EBR质量浓度为0.1 mg/L或大于0.1 mg/L时，生根效果不理想，甚至出现抑制生根现象（图 1-F，G，H）。

因此，诱导大西洋马铃薯幼苗不定根离体发生的最佳培养基配方为MS＋0.01 mg/LEBR＋0.1 mg/L NAA。

表1 不同植物生长调节剂组合对大西洋马铃薯幼苗不定根离体发生的影响

2.2 大西洋马铃薯茎段的不定根离体发生情况

将长势良好的茎段转接至不定根离体诱导的培养基中3～7 d后，茎段陆续出现不定根。

由表2可知，与不添加植物生长调节剂的处理相比，只添加0.1 mg/L NAA和只添加0.01 mg/L EBR的处理，启动时间均有所减少，生根频率和平均不定根数均有所增加，其中，以只添加0.1 mg/L NAA的处理生根频率较高，为68.33%；以只添加0.01mg/LEBR的处理不定芽诱导率较高，为45.16%（图 2-A，B，C）。

当NAA质量浓度为0.1 mg/L时，随着EBR质量浓度的升高，茎段不定根发生的启动天数逐渐减少，生根频率和不定芽诱导率先升高后下降。EBR质量浓度为0.01 mg/L，NAA质量浓度为0.1 mg/L的处理和EBR质量浓度为0.05 mg/L，NAA质量浓度为0.1 mg/L的处理生根频率均较高，分别为99.49%和99.10%，但后者的不定芽诱导率最高，为81.07%，且芽较健壮（图2-D，E）。而当EBR质量浓度较高时，生根频率明显降低，不定芽诱导效果也减弱（图2-F，G，H）。

可见，当NAA质量浓度为0.1 mg/L时，低质量浓度的EBR对茎段的不定根发生有促进作用；但当质量浓度较高时，出现抑制生根现象；此外，EBR在诱导不定芽方面有促进作用。

因此，诱导大西洋马铃薯茎段的最佳培养基配方为MS＋0.05 mg/LEBR＋0.1 mg/LNAA。

表2 不同植物生长调节剂组合对大西洋马铃薯茎段不定根离体发生的影响

2.3 大西洋马铃薯叶片的不定根离体发生情况

将长势良好的叶片转接至不定根离体诱导的培养基中5～10 d后，叶片陆续出现不定根。从表3可以看出，与不添加植物生长调节剂的处理相比，只添加0.1 mg/L NAA和只添加0.01 mg/L EBR的处理，启动时间有所减少，生根频率有所增加，且只添加0.1 mg/L NAA的处理效果更明显（图3-A，B，C）。当NAA质量浓度为0.1 mg/L时，随着EBR质量浓度的增加，叶片的生根频率先升高后降低；当EBR质量浓度为0.05 mg/L时，叶片生根频率最高，为82.06%，且根较粗壮，长势良好（图3-E）；但当EBR质量浓度高于0.05 mg/L时，叶片生根频率均较低，且根较细短，且随着EBR质量浓度的增加，叶片明显变黄，但仍比不添加植物生长调节剂的处理生根效果好（图3-F，G，H）。可见，EBR对马铃薯叶片的生根有一定的促进作用，低浓度的EBR能有效加强促进生根的效果。因此，诱导大西洋马铃薯叶片不定根离体发生的最佳培养基配方为MS＋0.05 mg/LEBR＋0.1 mg/LNAA。

表3 不同植物生长调节剂组合对大西洋马铃薯叶片不定根离体发生的影响

3 结论与讨论

将2，4-表油菜素内酯与马铃薯的离体再生相结合，为马铃薯不定根快速诱导提供了新的途径。本研究结果表明，适当浓度的2，4-表油菜素内酯对马铃薯不定根的发生有促进作用，幼苗在MS＋0.01 mg/LEBR＋0.1 mg/LNAA培养基中，生根频率可达到99.39%，每个无菌苗的平均不定根数为11.93条，且在2，4-表油菜素内酯作用下，幼苗的不定根发生的启动时间均较短，为3～5 d，最佳平均生根天数约为10 d。鲍红春等[9]以马铃薯品种陇薯5号的茎段为起始外植体，将其分化出来的健壮小苗在诱导生根时，15 d左右可观察到根的发生。白颖等[10]以马铃薯加工品种Shepody叶片、茎段为外植体，其不定芽长到2～3 cm时，将其剪下，置于MS基本培养基中，约10 d时可产生不定根，20 d时可进行离体扩繁。崔海辰等[11]研究表明，在外植体不定芽长到2～3 cm时，将其剪下，置于生根培养基中大概10 d时可看到不定根产生，到20 d时根的生长量大大增加。可见，在本研究中，2，4-表油菜素内酯的应用可显著减少马铃薯再生苗的生根时间，缩短组培苗滞瓶期，加快炼苗移栽进程，并且适当浓度的2，4-表油菜素内酯可使茎段、叶片直接诱导不定根。这与闫慧芳等[12]对有关油菜素内酯对巨桉组培中不定根诱导的研究结果一致。可尝试将2，4-表油菜素内酯应用于其他作物的快速发根上，以缩短生根时间。

李程等[13]研究表明，油菜素内酯化合物是国际上公认的一类高效、无毒的新型植物甾醇类生长激素。其能有效改善高温、低温、重金属、干旱、病菌侵染等多种生物与非生物逆境胁迫对植物体造成的伤害，增强植株对逆境胁迫的耐受力[14-17]。而马铃薯虽营养丰富、产量高、生育期短，但其易出现主要由病毒病引起的品种退化问题[18]。据统计，世界每年因病毒病造成的马铃薯减产至少在20%以上，严重时减产达到80%[19]。将2，4-表油菜素内酯应用于马铃薯的离体再生，不仅能缩短组培苗滞瓶期、加快种苗工厂化以及产业化进程，更有望提高马铃薯种苗的抗逆性，增强其对环境胁迫的抵抗能力，以实现高产优质的目标。