长针线虫Longidorus pinus的形态和分子鉴定

樊金玲，徐玉梅，赵增旗,2，王建明

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.新西兰皇家研究院土地环境研究所，新西兰奥克兰1072）

长针线虫属（Longidorus Micoletzky，1922）寄生在植物根际，不仅会造成植物根部肿大、生长不良，而且还会传播植物病毒，引起果蔬病害，严重时会造成产量损失[1]。因其具有种类多样性以及分布广泛等特点被研究人员广泛关注[2]。目前，该属全世界已报道的有160多种，其中，我国报道的有20种[2-11]。

本研究采用传统形态学和分子生物学（包括18S和28S的分子序列）相结合的鉴定方法，对采自山西介休的枣树根际土壤中的线虫进行种类鉴定，以明确该线虫的分类地位。

1 材料和方法

1.1 样品的采集

试验材料采自山西省介休市（112°10′14″E，36°50′01″N），取枣树根际土壤样本 1 000 g，编号JX10，装入封口袋中，做好标记带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 线虫标本的分离、制片和形态观察 采用浅盘法分离线虫[12]，应用改进的SEINHORST[13]方法脱水，将固定脱水的线虫采用改进的HOOPER[14]方法制成永久玻片，并将制好的永久玻片置于Nikon 80i显微镜下进行观察，用尼康Ds-Fi2拍照，用NIS Elements version 4.10软件测量形态并利用de Man公式计算测量指标a，b，c，c'和V，具体方法参照文献[15-16]。

1.2.2 线虫的DNA提取、PCR扩增和系统发育树的构建 取单头线虫采用改进的蛋白酶K裂解法提取DNA[17]。18S采用2对引物扩增，第1对的上、下游引物分别为：1096F（5′-GGTAATTCTGGAGCTA ATAC-3′），1912R（5′-TTTACGGTCAGAACTAGG G-3′）；第 2 对的上、下游引物分别为：1813F（5′-CT GCGTGAGGTGAAAT-3′），2646R（5′-GCTACCTTGT TACGACTTTT-3′）。28S的上、下游引物分别为：D2A（5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3′），D3B（5′-T GCGAAGGAACCAGCTACTA-3′）。PCR 扩增程序：95℃ 2.75 min；95℃ 1 min，53℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72℃7 min。采用XU等[18]的方法进行产物纯化，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。测序结果用Sequencher 5.1.2编辑拼接，并用Mrbays 3.1.2构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态学特征

其测量结果列于表1。

表1 供试线虫及其比较种群形态测量计值 μm

雌虫（图1-A～H）：虫体热杀死后呈J型或C型，体长 3 480～4 366 μm，唇宽 10.5～11.3 μm，明显缢缩。齿尖针纤细，69.8～81.7 μm，齿托基部微肿胀，导环距头前端30.6～33.6 μm。神经环到头前端的距离195～248μm，食道球圆柱形（（67～79）μm×（14～17）μm），阴门处体宽 27.3～36.1 μm，尾部圆锥形，尾长 32.3～41.5 μm（表 1）。

幼虫（图1-I～L）：仅发现1龄幼虫1头，除个体大小和生殖器官外，与雌虫均相似。虫体热杀死后呈 J型或 C型，体长 1 176 μm，口针 43.8 μm，替代口针52.2 μm，替代口针前端插入齿托内部。尾短，圆锥形，尾长 17.6 μm（表 1）。

未发现雄虫。

2.2 分子生物学特征分析

本试验种群对18S和28S测序分别获得1 559，746 bp，将其与NCBI中已有的序列进行了比对，其结果表明，18S序列相似度最高的是Longidorus（MF674014和MF674015），与MF674014相似率为99%（1 559 bp有1 bp空白差异），与MF674015相似率为100%（图2）。28S序列相似度最高的是Longidorus（MF674016～MF674019），与 4 条序列的相似率均为99%（图3）。

2.3 系统发育树构建

以 Paralongidoruslitoralis和 Paralongidorus paramaximus为外群，用GTR＋I模型构建的18S系统发育树如图2所示。本试验种群JX10与Longidorus pinus（MF674015 和 MF674014）在同一分枝上，置信度达100%。

以Paralongidorus maximus和Paralongidorus plesioepimikis为外群，用GTR＋G模型构建的28S系统发育树如图3所示。本试验种群JX10与Longidorus pinus（MF674016～MF674019）在同一分枝上，置信度达96%。

2.4 鉴定结果

综合形态学特征和分子生物学分析结果，将JX10鉴定为松树长针线虫Longidorus pinus。依照CHEN等[19]和PENEVA等[20]的多歧检索表，确定其鉴定代码为A23-B1-C23-D4-E1-F2-G23-H23-I1-J2-K6。

3 结论与讨论

本试验在形态学鉴定的基础上，采用18S和28S区的分子序列及其系统发育分析相结合的方法，将山西介休枣树根际土壤中分离的长针属线虫鉴定为Longidorus pinus。与XU等[3]标本相比，本试验种群雌虫的齿托较短（30.3～49.5 μm），尾部较长（32.3～41.5 μm），XU等[3]标本的齿托和尾长分别为42.1～54.3，30.9～39.7 μm。可能是由于不同的地理种群造成的种内差异。

松树长针线虫Longidorus pinus首次于山西省汾阳市、太谷北洸村、大同市平旺花园、太原市阳曲县和山西农业大学校园等地发现，其寄主包括松树、白蜡树、玉米、槐树和杨树。枣树为该线虫的新寄主。