淡红侧耳子实体多糖的分离纯化及结构探析

田有秋，贾金霞，束旭，任晓婕，关月，谢红，许杨洁，王昱沣

(南京农业大学 食品科学技术学院，江苏 南京，210095)

淡红侧耳是一种侧耳科、侧耳属的食用菌[1]，其色鲜味美，蛋白质、粗纤维、维生素和氨基酸等含量丰富[2]，作为一种兼食用、药用及观赏的食用菌而逐步被人们接受。多糖是组成生物体的一种高分子碳水化合物，不仅是细胞的结构材料，而且为细胞活动提供能量；它在细胞分化、代谢、生长、胚胎发育、免疫应答、抗血栓和抗肿瘤等方面发挥着重大作用[3]。淡红侧耳子实体粗多糖具有抗氧化等活性[4]，是一种重要的活性成分。针对淡红侧耳的研究目前主要包括营养成分分析[5-6]、提取条件优化[7]、深层发酵[8]、和菌丝体多糖[9]等方面，对其子实体多糖的纯化、纯化后的多糖结构和理化性质的研究尚未见报道。多糖结构与其生物活性息息相关，对纯化多糖的结构进行研究不仅有助于进一步开展药理学、毒理学研究以及结构修饰改造等，更可以为多糖类新药的开发提供理论依据。

本研究以实验室前期对该多糖的提取研究结果为基础[10]，首次对所获得的淡红侧耳粗多糖进行分离纯化，并对其纯化组分进行分子质量测定及单糖组成分析，采用紫外光谱、红外光谱及刚果红实验对其结构进行初步鉴定，且对其理化性质进行研究，为淡红侧耳多糖的进一步研究和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淡红侧耳，由广东银新现代农业股份有限公司提供。

DEAE-纤维素-52，葡聚糖标准品，Sigma公司；Sephadex G-150，台州市路桥四甲生化塑料厂；单糖标准品，上海源叶生物科技有限公司；甲醇：(色谱纯)，KBr：(光谱纯)，无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯)，苯酚、刚果红、葡萄糖糖醛酸、K2SO4、H2SO4、NaCl(分析纯)，南京化学试剂股份有限公司；咔唑、三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，阿拉丁试剂。

1.2 仪器与设备

层析柱，上海煊盛生化科技有限公司；STARTER 3100冷冻干燥机，奥豪斯仪器有限公司；LNG-T83B 离心浓缩仪，太仓华利达实验室设备公司；EU-2600R紫外可见分光光度计，上海昂拉仪器有限公司；HL-2S恒流泵，上海沪西分析仪器有限公司；Nicolet IR200 红外光谱仪，美国Nicolet公司；Waters 1525高效液相色谱仪，美国Waters公司；DBS-100电脑全自动部分收集器，上海沪西分析仪器有限公司；LC-20AD岛津高效液相色谱仪，美国岛津公司； RE52-99旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；

1.3 方法

1.3.1 淡红侧耳粗多糖的提取

将淡红侧耳子实体干品洗净、烘干后粉碎，称取2.0 g细粉，按固液比1∶30.6 (g∶mL)，提取温度95 ℃，提取时间3.9 h的条件进行水提醇沉，抽滤后得粗多糖粉末；将粗多糖粉末复溶至1.0 mg/mL，采用大孔阴离子交换树脂D315按树脂用量0.1 g/mL，pH 6，45 ℃，120 min的条件进行静态脱色；采用Sevage法对脱色后的多糖溶液进行脱蛋白；透析48 h后冷冻干燥，得淡红侧耳粗多糖[10]。

1.3.2 淡红侧耳粗多糖的分离纯化

1.3.2.1 DEAE-纤维素-52 阴离子层析柱纯化淡红侧耳多糖

称取80.0 mg淡红侧耳粗多糖溶于8 mL去离子水中，上样于层析柱(Φ26.0 mm×300.0 mm)，装柱体积1 BV (设定1 BV=133 mL)；分别用0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱(流速1 mL/min，10 min/管)；苯酚-硫酸法[11]检测偶数管多糖含量，绘制洗脱曲线，收集不同组分；50 ℃浓缩至约30 mL，去离子水透析48 h，将透析液真空冷冻干燥，得多糖各组分[12]。

1.3.2.2 Sephadex G-150层析柱纯化淡红侧耳多糖

分别称取20.0 mg上述多糖组分溶于5 mL去离子水中，上样于层析柱(Φ16.0 mm×300.0 mm)，装柱体积1 BV (设定1 BV=50 mL)；用去离子水洗脱(流速0.3 mL/min，10 min /管)；以管数为横坐标，A490为纵坐标，绘制洗脱曲线，根据峰值分别收集不同组分；50 ℃浓缩至约30 mL，去离子水透析48 h，冷冻干燥后得多糖终纯化产物。

1.3.3 淡红侧耳多糖的纯度及相对分子质量测定

1.3.3.1 高效液相色谱条件

Waters 1525 高效液相色谱仪(配2410示差折光检测器和Empower工作站)；检测柱为UltrahydrogelTMLinear (Φ7.8 mm×300.0 mm)；流动相为0.1 mol/L NaNO3；柱温30 ℃，流速0.9 mL/min，进样量20 μL。

1.3.3.2 标准曲线的绘制

称取不同相对分子质量的葡聚糖标品50.0 mg于25 mL容量瓶中，用流动相溶解，定容；上样前用0.45 μm滤膜过滤，以保留时间为横坐标，相对分子质量的对数值为纵坐标制作标曲。

1.3.3.3 样品的测定

将淡红侧耳纯化多糖用流动相溶解，同上操作，将保留时间代入标曲，计算相对分子质量。

1.3.4 淡红侧耳多糖的单糖组成分析

1.3.4.1 高效液相色谱条件

LC-20AD岛津高效液相色谱仪(配SPD-20A紫外-可见检测器和LC solution色谱数据工作站)；色谱柱：Thermo C18色谱柱(Φ4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流动相：0.1 mol/L PBS (pH 6.7)和乙腈(体积比为83∶17)；柱温30 ℃，流速0.7 mL/min，进样量20 μL；检测波长245 nm。

1.3.4.2 混合单糖标品衍生化

分别称取10种单糖标准品各3.0 mg，溶解到1 mL去离子水中；分别取0、20、40、60、80、100 μL混合单糖标品溶液，补水至100 μL，再加入100 μL NaOH溶液(0.6 mol/L)，混匀；取100 μL混合液，加入等体积的PMP-甲醇溶液(0.5 mol/L)，混匀，70 ℃水浴100 min，30 min后加入100 μL HCl (0.3 mol/L)中和，于50 ℃浓缩仪中旋干溶液；依次加入去离子水、氯仿各1 mL，混匀静置分层后吸取水相，如此重复3次，最终水相用0.45 μm水系滤膜过滤后进行高效液相色谱分析[13-14]。

1.3.4.3 样品的测定

分别称取3.0 mg PDP-1、PDP-2-1和PDP-2-2，用去离子水配成3 mg/mL溶液；取100 μL多糖溶液，加100 μL TFA (4 mol/L)，于120 °C干燥箱中反应2 h；冷却后加入200 μL甲醇，于50 ℃浓缩仪中旋干，如此重复3次后，分别加100 μL去离子水进行衍生化，0.45 μm水系滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。

1.3.5 理化性质的测定

1.3.5.1 总糖含量

分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖标准液(40 μg/mL)和1 mL多糖样品溶液(0.05 mg/mL)，用去离子水补至2 mL；加入1 mL苯酚溶液(质量分数为6%)，摇匀后迅速加入5 mL浓硫酸，混匀，静置20 min后，测A490。以葡萄糖质量为横坐标，A490为纵坐标，绘制标准曲线。将多糖样品测得的吸光值带入标曲，进而求得多糖样品中的总糖含量[11]。

1.3.5.2 蛋白质含量

分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牛血清白蛋白标准液(100 μg/mL)和1 mL多糖样品溶液(3 mg/mL)，用去离子水补至1 mL；加入5 mL考马斯亮蓝G-250，摇匀后测A595。以牛血清白蛋白质量为横坐标，A595为纵坐标，绘制标准曲线。测得样品吸光值，依据标曲计算蛋白质含量[15]。

1.3.5.3 糖醛酸含量

分别取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL葡萄糖醛酸标准液(200 μg/mL)和1 mL多糖样品溶液(0.14 mg/mL)，用去离子水补至1 mL，加入5 mL四硼酸钠-硫酸溶液(9.54 mg/mL)，混匀，沸水浴10 min，冷却后加入0.2 mL咔唑-乙醇溶液(1.25 mg/mL)，混匀，沸水浴15 min，冷却后测A530。依据标准曲线计算多糖样品中的糖醛酸含量[16]。

1.3.5.4 硫酸基含量

分别取0、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL硫酸钾标准液(0.6 mg/mL)，用1 mol/L盐酸补至0.2 mL，加入3.8 mL TCA(30 g/L)；加1 mL氯化钡-明胶溶液(5 g/L)混匀，记为A1，加1 mL明胶溶液(5 g/L)，记为A2；混匀后静置20 min，测A360。取10.0 mg多糖样品，溶于1 mL盐酸(1 mol/L)，于100 ℃水解6 h，冷却，50 ℃浓缩至干；加1 mL去离子水复溶，取0.2 mL复溶液同上处理。以硫酸钾质量为横坐标，A1、A2差值为纵坐标，绘制标准曲线。依据标曲计算多糖样品的硫酸基含量[17]。

1.3.6 淡红侧耳多糖的光谱分析

1.3.6.1 紫外光谱分析

分别将淡红侧耳粗多糖和纯化多糖样品配制成0.5 mg/mL的溶液，于200～400 nm进行紫外-可见光谱扫描，观察其在260～280 nm有无吸收峰[18]。

1.3.6.2 红外光谱分析

取适量KBr于100 ℃干燥箱中烘干至恒重，称取100.0 mg干燥KBr，于玛瑙研钵中研磨至细，用压片机压成透明薄片后用于空白实验基线校正；再分别称取1.0 mg多糖样品与100.0 mg干燥KBr，充分研磨后压成透明薄片，于4 000～400 cm-1进行扫描[19]。

1.3.7 刚果红实验分析

分别称取5.0 mg三种多糖组分，加入2 mL蒸馏水，充分溶解后加入2 mL刚果红试剂(80 μmol/L)，混匀；依次加入0.44、1.00、1.70、2.70、4.00 mL NaOH溶液(1 mol/L)，NaOH最终为0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L。于紫外-可见分光光度计中，在200～800 nm扫描，测量各NaOH浓度下溶液的最大吸收波长。不加多糖样品，按相同方法测量空白条件下的最大吸收波长[20]。

1.3.8 数据处理

实验数据均重复3次取平均值，使用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 淡红侧耳粗多糖的分离纯化

2.1.1 DEAE-纤维素-52层析柱纯化

由图1可知，淡红侧耳粗多糖经DEAE-纤维素-52层析柱纯化后得到4个组分，分别为去离子水洗脱的组分PDP-1，0.1 mol/L NaCl洗脱的2个组分PDP-2和PDP-3以及0.3 mol/L NaCl洗脱的组分PDP-4。组分PDP-4得率过低，不易于收集，由于时间有限，故只收集前3个组分继续过Sephadex G-150层析柱。

图1 淡红侧耳粗多糖经DEAE-纤维素-52层析 柱纯化的洗脱曲线Fig.1 Elution curve of crude Pleurotus djamor polysaccharides on DEAE-cellulos-52 column

2.1.2 Sephadex G-150层析柱纯化

由图2可知，PDP-1、PDP-2和PDP-3经Sephadex G-150层析柱纯化后各得到一个组分，即PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1。这3个组分都呈现单一对称峰，表明所得组分为较纯多糖。分别收集这3个组分，50 ℃旋蒸浓缩，透析后真空冷冻干燥，得到白色絮状的淡红侧耳多糖纯品PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1。

2.2 淡红侧耳多糖的纯度及相对分子质量测定

由图3可知，淡红侧耳多糖纯化组分PDP-1-1、PDP-2-1、PDP-3-1的高效液相色谱图呈现单一对称峰，表明组分纯度较高。三组分的保留时间分别为17.175、17.309、13.956 min，根据标准曲线计算可得，三组分的相对分子质量分别为：12.9、10.6、2 753.7 kDa。

2.3 淡红侧耳多糖的单糖组成分析

由图4可知，单糖标品的保留时间如下：甘露糖(tR=16.030 min)，核糖(tR=20.830 min)，鼠李糖 (tR=21.700 min)，葡萄糖醛酸(tR= 23.770 min)，半乳糖醛酸(tR= 26.570 min)，葡萄糖(tR=31.412 min)，半乳糖(tR=35.426 min)，木糖(tR=37.710 min)，阿拉伯糖(tR=38.623 min)，岩藻糖(tR=44.400 min)。纯化组分PDP-1-1由甘露糖(tR=16.011 min)、葡萄糖(tR=31.403 min)、半乳糖(tR=35.413 min)、阿拉伯糖(tR=38.944 min)、岩藻糖(tR=44.131 min)5种单糖组成，各单糖物质的量百分比分别为：4.79%、28.68%、47.59%、13.37%、5.57%；PDP-2-1由甘露糖(tR=16.155 min)、葡萄糖(tR= 31.424 min)、半乳糖(tR=35.179 min)、木糖(tR=37.611 min)、阿拉伯糖(tR=39.296 min)、岩藻糖(tR=43.819 min)6种单糖组成，各单糖物质的量百分比分别为：6.43%、33.65%、36.17%、7.20%、9.88%、6.68%；PDP-3-1由甘露糖(tR=16.366 min)、葡萄糖(tR= 31.307 min)、半乳糖(tR=35.019 min)、岩藻糖(tR=44.501 min)4种单糖组成，各单糖物质的量百分比分别为：4.12%、87.24%、3.90%、4.74%。

图2 PDP-1、PDP-2、PDP-3经Sephadex G-150层析柱纯化的洗脱曲线Fig.2 Elution curve of PDP-1、PDP-2、PDP-3 on Sephadex G-150 column

图3 淡红侧耳纯化多糖的高效液相色谱图Fig.3 HPLC of purified Pleurotus djamor polysaccharides

图4 混合单糖标准品及淡红侧耳纯化多糖的高效液相色谱图Fig.4 HPLC of mixed standard monosaccharide and purified Pleurotus djamor polysaccharides

2.4 理化性质的测定

总糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量、硫酸基含量的标准曲线分别为：y=0.007 4x+0.001 3(R2=0.999 5)，y=0.003 5x-0.014 0(R2=0.998 4)，y=0.012 5x+0.023 1(R2=0.999 3)，y=0.001 7x-0.040 4(R2=0.999 6)。粗多糖及纯化组分中总糖、蛋白质、糖醛酸及硫酸基的具体含量见表1。由表1可知，与淡红侧耳粗多糖相比，纯化组分PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1的总糖含量明显增加；纯化组分的蛋白质含量减少，分别仅剩0.48%、0.79%、0.64%，这与紫外光谱分析结果一致；PDP-3-1的糖醛酸及硫酸基含量均高于粗多糖、PDP-1-1和PDP-2-1。有研究显示糖醛酸和硫酸基含量与多糖的生物活性呈正相关，乔德亮[21]从三角帆蚌中纯化出3种多糖组分HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3，HCPS-3含有的糖醛酸和硫酸基均高于其他两组分，生物活性分析结果表明HCPS-3比HCPS-1和HCPS-2具有较高的体外抗氧化活性和免疫增强活性。

表1 淡红侧耳粗多糖及纯化多糖的理化性质Table 1 Physicochemical properties of crude and purified Pleurotus djamor polysaccharides

2.5 淡红侧耳多糖的光谱分析

2.5.1 紫外光谱分析

由图5可知，淡红侧耳粗多糖在260～280 nm有吸收峰，表明其含有蛋白质和核酸；纯化组分PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1在此处均无明显吸收峰，表明这3种纯化组分不含有或含有较少的蛋白质和核酸等物质，这与理化性质测定结果一致。

图5 淡红侧耳粗多糖及纯化组分的紫外光谱图Fig.5 Ultraviolet spectra of crude and purified Pleurotus djamor polysaccharides

2.5.2 红外光谱分析

图6 淡红侧耳多糖纯化组分的红外光谱图Fig.6 Infrared spectra of purified Pleurotus djamor polysaccharides

2.6 刚果红实验分析

刚果红是一种酸性染料，可与具有三股螺旋结构的物质发生络合作用，使溶液的最大吸收波长增加。当NaOH浓度较低时，溶液的最大吸收波长由于络合作用的发生而增大；NaOH浓度逐渐升高时，最大吸收波长由于三股螺旋的解开而减小。由图7可知，纯化组分PDP-1-1和PDP-3-1的最大吸收波长先增加后减小，说明其含有三股螺旋，而PDP-2-1的最大吸收波长一直呈减小趋势，说明其不含三股螺旋结构。

图7 NaOH浓度对淡红侧耳纯化多糖的影响Fig.7 Effect of NaOH concentration to purified Pleurotus djamor polysaccharides

3 结论

淡红侧耳粗多糖经DEAE-纤维素-52和Sephadex G-150纯化后共得到了3种组分PDP-1-1、PDP-2-1和PDP-3-1；采用高效凝胶过滤色谱法测定纯度及相对分子质量，可得三组分均为单一对称峰，说明纯化多糖的纯度较高；采用柱前衍生高效液相色谱法测定单糖组成，可知PDP-1-1主要由半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖等5种单糖组成，PDP-2-1主要由半乳糖和葡萄糖等6种单糖组成，PDP-3-1由葡萄糖和岩藻糖等4种单糖组成；紫外扫描和理化性质测定结果均表明3种纯化多糖含有极少量的蛋白质和较高的糖醛酸；红外扫描结果显示三组分均为吡喃糖，PDP-1-1和PDP-2-1以β-型糖苷键连接；刚果红结果显示PDP-1-1和PDP-3-1具有三股螺旋结构而PDP-2-1不具有三股螺旋结构。

多糖的结构与其生物活性密切相关，对多糖结构的深入研究，可推动多糖类新药的开发。目前对淡红侧耳多糖结构的解析只涉及特征官能团和单糖组成方面，为进一步了解糖苷键构型及单糖残基的连接方式等，还需进行甲基化和核磁共振分析，以期为其生物活性和构效间关系研究提供理论依据。