基因表达谱在内耳研究中的作用

金昊吴昊卓越洪文嘉郑考唐霄雯郑斌娇*

1浙江省医学遗传学重点实验室(温州325035)

2温州医科大学Attardi线粒体生物医学研究院(温州325035)

1 基因表达谱相关技术

ISH是一项原始的基因表达谱技术，将特异探针与组织、细胞或染色体上目的核酸互补配对形成专一的核酸杂交分子，后经一定的检测手段将目的核酸的位置显示出来。但是由于研究范围的局限性，只能研究单个或小群体基因的表达，所以当高通量基因表达分析技术出现后迅速被取代。DNA微阵列技术通过小范围内大量目的DNA与探针之间的杂化，可以快速准确地分析出靶向物整个转录组的基因表达水平，因此能识别出更多目的基因调控的潜在靶基因。

NGS的出现推动了不需要探针的新技术的发展，同时具备成本低、时间短和精度高等优点。基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）技术将cDNA作为多连体进行切割和测序，产生独特的表达序列标签，从而近乎完整地获得全基因组表达信息。转录组测序技术（RNA sequencing,RNA-Seq）是NGS的最新研究成果，它通过高通量测序技术检测出转录组的表达水平，从而帮助认识目的基因的结构与功能。

第三代测序技术SMS不需要进行PCR扩增，主要有Helicos的单分子测序技术（ture single molecule sequencing,TSMS）、PacBio的单分子实时测序技术(single molecule real time,SMRT)和Oxford Nanopore的纳米孔单分子测序技术（也有称第四代测序技术）。前两者的原理相同：通过荧光标记的脱氧核苷酸掺入目的DNA检测，荧光基团一旦和DNA形成化学键即消失，因此不会影响目的DNA。纳米孔单分子测序技术的核心是一块由α-溶血素组成的并结合有核酸外切酶的纳米孔道，靶向物穿过孔道时每一个碱基就会产生一个特异阻断电流，由此获得靶向物序列。目前，SMS仍在高速发展过程中，也许在未来几年NGS主导的基因表达谱应用格局还会延续，但是完善的SMS平台必将引领生物学界向更深层次发展。

2 基因表达谱对研究毛细胞再生的作用

毛细胞是听觉感受器，在人体内数目不断减少，但部分动物的毛细胞具有再生功能。Hawkins等利用适用于禽类椭圆囊和基底乳头感觉上皮细胞的特异性探针检测人的DNA序列，首次明确了禽类作为识别哺乳动物潜在耳聋位点的模型的作用[1]。在遗传病变尚未明确时，可以通过这种方法识别一些未知的耳聋表达相关转录因子。Hawkins等分别用新霉素和激光消融处理毛细胞，研究禽类椭圆囊和基底乳头的再生感觉上皮基因谱，发现许多保守的信号通路、细胞凋亡和细胞周期过程中与转录相关的基因在再生阶段会受到不同程度的调控[2]。近年来也有研究者通过RNA-Seq分析幼鸡椭圆囊以识别氨基糖甙类处理后毛细胞再生的转录组，共识别出约500个新的特异毛细胞基因以及超过200个处于再生阶段的差异转录因子[3]。

斑马鱼是研究毛细胞再生的热门模型。研究者使用NGS确定了受噪音损伤的成年斑马鱼的毛细胞再生基因调控网络，发现stat3/socs3信号通路是这一过程中关键的调节器[4]。鱼的侧线器官中也存在毛细胞，因此也常被用于毛细胞再生研究。Bao等发现H3K27me3去甲基化酶受到抑制后，诱发毛细胞凋亡并降低其再生能力[5]。Mizutari等发现鱼的Notch信号通路在毛细胞损伤后下调，提示哺乳动物和非哺乳动物之间的差异比较可能可以揭示毛细胞再生的潜在性[6]。

表1 特定内耳组织和细胞类型的基因谱相关技术Table 1 Gene prof i ling of specif i c tissues and cell types

3 基因表达谱对分析特定内耳组织和细胞类型的作用

明确特定组织和细胞层面的转录谱能全面地了解内耳分子功能，但是因为组织稀缺以及内耳细胞类型复杂等因素很难实现。Sajan等使用高精度的微阵列技术率先完成了对小鼠内耳从第9胚胎日到第15胚胎日分化过程的基因综合分析，并且识别出50余种信号通路[7]。从此，基因谱技术由于其准确性和高效性而被广泛用于特定内耳组织和细胞类型的研究（表1[8-16]）。Cristobal等首次将激光捕获显微切割技术应用在成年大鼠的壶腹嵴，发现了超过400种支持细胞和毛细胞的基因表达差异[13]。McDermott等通过将斑马鱼体内分离的毛细胞和肝脏的mRNA杂交，得到寡核苷酸DNA微阵列，识别出包括毛细胞转录组在内的超过1000个基因[14]。Kurima等分析发现在内耳感觉上皮优势表达的基因启动子处，锌指转录因子Zeb1结合位点发生变化，这可能是Zeb1小鼠突变体发育阶段形成畸形内耳以及包括Zeb1结合位点在内的很多基因在突变体中出现异常的诱因[8,17]。另一项研究使用流式细胞荧光分选技术（f l uorescence-activated cell sorting，FACS）纯化新生小鼠耳蜗的毛细胞和周围非感觉群体，结果纯化后的耳蜗支持细胞和小上皮嵴细胞增殖分化，说明它们的再生能力和周围的毛细胞存在差异[9]。Lu等确定了FACS纯化后从轴突延伸到螺旋神经节神经元的听觉生成发展过程的完整表达谱，促进了特异性转录和轴突导向因子的识别[10]。Haraksingh等通过外显子组测序技术和DNA微阵列技术对3个携带肌球蛋白重链7B（myosin heavy chain 7B，MYH7B）基因的耳聋家系进行研究，首次发现一个包含吡哆醛依赖性脱羧酶结构域含蛋白1（pyridoxal-dependent decarboxylase domain containing 1，PDXDC1）基因的染色体片段在患病家系成员中显著缺失[18]。

4 基因表达谱对研究突变小鼠的作用

迄今为止基因谱技术最广泛的应用之一就是通过小鼠突变体和野生型动物的比较分析来识别基因突变引起表达改变的潜在靶基因，阐明参与内耳发育、毛细胞再生和耳聋发病机理等不同过程的潜在分子机制。

Urness等将不会诱导内耳发育的成纤维细胞生长因子3（f i broblast growth factor,FGF3）和FGF10双突变体作为研究内耳感应基因的一种模型，通过对耳区进行RNA ISH证明一些基底特定基因表达下调[19]。同时FGF3和FGF10的缺失也与后脑表达Wnt8的下调有关，这也使耳基板FGF的诱导形成与它对菱脑原节4或5-6节后部的限制之间建立联系。Hertzano等首次对缺乏毛细胞存活所需转录因子Pou4f3的小鼠突变体内耳进行DNA微阵列分析，识别并确认了编码转录阻遏蛋白的生长因子独立因子1（growth factor independent factor 1,Gfi1）是Pou4f3的靶向物[20]。Matern等对Gfi1突变小鼠进行RNA-Seq检测，显示早发性听力损伤和毛细胞再生功能缺陷[21]。Kammerer使用ISH发现癌胚抗原细胞粘附分子会导致哺乳动物听觉上出现低、高频率损伤[22]。Tekin等使用全基因组测序技术发现耳聋小鼠存在跨膜蛋白SLITRK6突变，提示其可能影响听觉神经在突触的转运过程[23]。

很多研究已经通过小鼠突变体说明毛细胞基因表达缺失的后果。Libby等对携带肌球蛋白XV基因突变的shaker2突变小鼠进行了实验，发现该突变导致毛细胞静纤毛缺陷的同时引起耳聋[24]。缺少视网膜母细胞瘤基因（retinoblastoma gene,Rb1）的小鼠突变体耳蜗毛细胞受到损伤，但椭圆囊中的毛细胞不受影响[25]。一项DNA微阵列的比较分析显示，Rb1突变耳蜗中参与Wnt和Notch信号通路的转录增加，而椭圆囊中细胞增殖和存活相关转录更为活跃[26]。胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）的缺失会导致人和小鼠耳聋，IGF-1突变小鼠耳蜗的基因谱显示转录因子FoxM1、Six6和Mash1上调[27]。缝隙连接蛋白30（connexin 30,Cx30）的缺失会导致血管纹电位调控功能破坏并引起突变小鼠耳聋[28]。高半胱氨酸是内皮功能障碍的相关因子，也可作为支持血管纹的毛细血管屏障，Cx30突变体小鼠的DNA微阵列分析发现高半胱氨酸的增加[29]。

5 基因表达谱对认识年龄相关性听觉丧失的作用

环境的改善和药物水平的提高延长了人类的寿命，但是这也导致和年龄相关的感觉功能障碍在全世界范围内呈现上升趋势。老年性聋是最普遍的具有年龄特征的感觉功能障碍。最近一项研究比较了年龄相关性听觉丧失的DBA/2J型小鼠在2个月和8个月时耳蜗基因的表达，发现大量8个月大的小鼠出现年龄相关性耳聋症状[30]。耳蜗的DNA微阵列分析显示，这些小鼠身上出现的年龄相关性聋与耳蜗中调节线粒体呼吸链复合体的基因显著下调有关。因为听觉随寿命不断丧失，γ-氨基丁酸受体表达水平在CBA小鼠（一种人老年性耳聋的模型）中受到不同程度的调控。对该模型进行进一步研究发现细胞凋亡相关基因和抗氧化系统对老年性聋的影响[31]。Marano等报道了引起催乳素和生长激素强烈上调的年龄相关基因表达的变化[32]。另有研究表明缺少三叶因子3（trefoil factor 3,Tff3）肽的小鼠会遭受年龄相关的听力丧失，DNA微阵列分析则显示转录调节保全素Pttg1和蛋白酶抑制剂serpina3n能够有效减弱这种损伤[33]。其他研究者也发现谷氨酸相关基因表达随着年龄增长发生改变，提示其可能对年龄相关性聋产生影响[34-35]。

6 基因表达谱对了解内耳损伤调控机制的作用

内耳感音神经功能可能因为直接病变、过度噪音干扰或者药物干预造成损伤。对大鼠耳蜗的研究发现转录因子、细胞因子和氧化应激相关基因等基因在噪音暴露下数小时后表达上调的现象，持续受到损伤24小时后，抗氧化和炎症的通路增加[36]。Cai等通过RNA-Seq获得了小鼠免疫系统相关基因分子谱，发现噪音强度干扰了用于支持细胞的Toll样受体信号通路的基因转录水平[37]。Park等在连续噪音损伤的小鼠模型中对半胱氨酰白三烯信号进行了检测，观察到半胱氨酰白三烯受体1型（cysteinyl leukotriene type 1 receptor,CysLTR1）在螺旋器中增多。在噪音损伤后使用白三烯受体拮抗剂（leukotriene receptor antagonist,LTRA）进行治疗有效降低了毛细胞损伤，同时观察到听阈降低[38]。

体外形成的听觉毛细胞需要NF-kappaB信号才能存活，NF-kappaB复合体还能参与细胞对有害刺激的免疫反应。Nagy等通过DNA微阵列探索此通路下游的转录变化，发现细胞内重要的信号传导效应分子磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）调节亚基上调[39]。耳蜗中NF-kappaB抑制剂处理引起的PI3K通路障碍导致促凋亡基因Caspase-3的活化，揭示了毛细胞存活过程中各通路间的联系。

7 基因表达谱对分析药物影响的作用

抗利尿激素（anti-diuretic hormone,ADH）是由调控身体水含量的神经垂体分泌的一种激素。通过基因表达谱分析，注射ADH对基因表达的影响得到证实。内淋巴液产量增加或吸收减少会导致水通道蛋白表达的变化，而水通道蛋白基因表达水平的改变也和老年性耳聋的形成有关[40]。

由于具有抗炎作用，地塞米松等糖皮质激素也被用于治疗急性感觉神经性听力损失。在小鼠耳蜗中，地塞米松会对基因表达造成干扰，具有抗炎、细胞应激或防止氧化损伤的潜在细胞保护作用的基因表达也受到影响[41]。Takumi等将地塞米松作为豚鼠耳蜗移植物的一部分置于在地塞米松洗脱电极的环境中，再将正常电极和未处理的耳蜗基因谱进行比较，发现携带地塞米松洗脱电极的动物显示出移植物引起的免疫反应相关基因下调的趋势[42]。

高剂量的氨基糖甙类抗生素会诱导耳蜗毛细胞的凋亡。DNA微阵列分析庆大霉素处理后的大鼠外植体培养物，结果显示由活性氧与N-甲基-D-天冬氨酸受体介导的细胞应激相关基因表达下调[43]。DNA微阵列分析显示水杨酸注射3小时后小鼠耳蜗中87种基因表达上调，提示药物水杨酸在使用时可能引起暂时性听力损失或者耳鸣[44]。

8 展望

近些年来以DNA微阵列和NGS为基础的基因谱研究持续发展，并已开发出第三代测序技术，广泛应用于不同情况下组织或特定细胞类型的基因表达水平复杂性的分析。新的基因表达谱技术的发明不仅提供了快速获取基因表达水平的简单方法而且更加经济实惠。由于mRNA水平未必会对蛋白质表达水平产生影响，在翻译后可能出现蛋白质磷酸化等进一步变化，因此蛋白质水平的变化必将成为下一个关注重点。通过荧光差异双向电泳技术（2D-DIGE）、抗体DNA微阵列技术或液相色谱-质谱联用技术可以对大型蛋白质组进行操作分析。一些相关的内耳研究已经依靠这些技术在推进，例如毛细胞带状突触蛋白质组和纤毛的确定以及耳蜗的耳毒性或噪音伤害的影响等。因此，未来的内耳研究很可能是以基因谱技术和蛋白质组学技术为基础的基因分析组合，生物信息学工具的后续使用将根据单细胞分辨率实现对候选基因或潜在通路的快速识别，这些都将极大地推动内耳的相关研究。