一种枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的颉颃作用研究

朱晶婷，赵 波，蓝志豪，何竺柳，李 壮，裘丽君，张 翎，储张杰

（浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022）

凡纳滨对虾Penaeus vannamei是目前世界上养殖产量最高的三大虾类之一[1],然而随着对虾养殖规模的不断扩大,集约化程度不断提高,对虾养殖病害发生频率亦相应增加[2]。其中早死综合征（Early mortality syndrome，EMS）又称急性肝胰腺坏死病（AHPNS），是近年来危害凡纳滨对虾最为严重的疾病，主要由高致病性副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus引起[3]。有研究表明养殖水体中副溶血弧菌浓度超过1.5×103CFU/mL[4]，虾池内极易发生早死综合征。不仅如此，副溶血弧菌还会引起对虾体内机能协调失常、免疫力降低等[5]，这迫使人们开始研究其发病原因,寻找诊断[6]、控制和防治的方法[7]。

20世纪，抗生素的发现促进了人类医学的巨大进步，水产养殖业亦不断受益。研究显示，庆大霉素、红霉素、环丙沙星等多种抗生素均能有效的抑制副溶血弧菌菌株的生长，可作为防治弧菌病的药物。但由于抗生素的长期不合理使用，副溶血弧菌的耐药性越来越强，且出现了多重耐药性问题[8]，引起了国内外的广泛关注[9]。

随着益生菌研究的日益增多，其在水产养殖上的应用迅速发展。许多研究表明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis可有效抑制弧菌的生长，提高凡纳滨对虾抗致病性副溶血弧菌的感染能力[10]，但对其用药量和用药频率并没有详细的说明。本文通过研究枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌生长繁殖的影响，以期找到枯草芽孢杆菌对不同浓度副溶血弧菌最适宜的菌种用量和用药频率，为水产动物细菌性疾病的防控提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种来源

试验用枯草芽孢杆菌菌种由南京茂捷微生物科技有限公司提供；试验用副溶血弧菌从岱山县和谐水产养殖有限公司的对虾养殖水样中分离，通过涂TCBS琼脂平板获得单菌落，经生理生化鉴定、科赫法感染鉴定，确定为致病性副溶血弧菌。

1.1.2 培养基

营养肉汤琼脂培养基：500 mL蒸馏水、1.5 g普通肉汤、1.5 g可溶性淀粉、2.5 g NaCl、硫酸锰20 mg、7.5 g琼脂、pH 7.0～7.2。

TCBS琼脂培养基：取8.9 g TCBS琼脂培养基粉煮沸溶解于1 000 mL蒸馏水中，冷却至60℃时倾入无菌平皿中。

1.1.3 实验仪器

紫外分光光度计（上海棱光技术有限公司220V，50 Hz）、立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂，LDZX-75KBS）、电热恒温培养箱（宁波江南仪器厂，DP303A-2FD）、双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司，SW-CJ-2FD）、电炉（嘉兴欣欣仪器设备有限公司，CD-20APX）。

1.2 实验方法

1.2.1 菌液ODX值标准曲线绘制

通过全波长扫描（300～800 nm以内）实验确定两种菌出现吸收峰的吸收波长。分别绘制2种菌液ODX值与相对浓度（0.1～1之间）及菌落总数之间的标准曲线，从而计算出枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌菌悬液的初始浓度。

1.2.2 枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的不同比例混合竞争培养

通过稀释初始浓度菌液，使液体培养基中枯草芽孢杆菌浓度和弧菌浓度比例为 1：100、1：50、1：10、1：1、10：1、50：1、100：1 的 7 个浓度试验组及 1：0、0：1 2 个对照试验组。取 9 个 1 500 mL 的锥形瓶，加入 998 mL的液体培养基，加入相应浓度菌液，置于37℃、150 r/min的摇床中培养。在试验开始4 h，8 h，12 h，24 h时在每组中取1 mL菌液，稀释到最适浓度涂营养肉汤平板和TCBS平板各3组，同时设置2组平行组，记录数据取平均值。每次取完1 mL菌液后补充1 mL液体培养基。

1.2.3 琼脂扩散法

将含有枯草芽孢杆菌菌液的滤纸片贴在已接种了副溶血弧菌的琼脂表面上，接种浓度比见表1，每个比例设置2个平行组，于37℃恒温箱中培养。每隔12 h用毫米尺量取抑菌圈直径，跟踪检测60 h，选取外圈成圆形的抑菌圈进行测量，同时提取抑菌圈里面的物质取样，并通过革兰氏染色与显微观察确定细菌种类。

表1 琼脂扩散法Tab.1 Agar diffusion method

1.3 数据处理

数据处理采用Excle2007、Origin9.1进行统计和处理。液体混合竞争培养中，枯草芽孢杆菌所占百分比即其抑菌率=（营养肉汤平板的细菌菌落总数-TCBS平板的细菌菌落总数）/营养肉汤平板的细菌菌落总数；琼脂扩散法中抑菌率%=（抑菌圈直径-滤纸片直径）/抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 菌液ODX值标准曲线

通过全波长测试，确定了两种菌出现吸收峰的吸收波长，ODX（枯草芽孢杆菌）=600 nm；ODX（副溶血弧菌）=595 nm；并绘制菌悬液ODX值与相对浓度标准曲线（图1）及菌悬液ODX值与细菌总数标准曲线（图2）。根据关系曲线配置测算得枯草芽孢杆菌的初始浓度为1.31×107CFU/mL、副溶血弧菌的初始浓度为1.22×107CFU/mL。

图1 枯草芽孢杆菌和和副溶血弧菌OD值标准曲线Fig.1 Standard curve of OD value of B.subtilis and V.parahaemolyticus

图2 枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌菌液总数与OD值关系曲线Fig.2 The relationship between the total number of B.subtilis and V.parahaemolyticus and OD

2.2 不同比例下枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的颉颃作用

培养24 h结束后，测定混合菌液中枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的总量（表2），观察各比例处理下枯草芽孢杆菌的抑菌率随时间变化（图3）。总体来看枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌有较好的颉颃作用，且相对浓度越高颉颃作用越明显，其中组7比例（杆菌：弧菌=100：1）抑制效果最佳，4 h后弧菌完全被抑制，组6（杆菌：弧菌=50：1）8 h 后弧菌完全被抑制。组 5（杆菌：弧菌=10：1）24 h 后抑菌率可维持在 88%以上；组 4（杆菌：弧菌=1：1）24 h后抑菌率可维持在80%以上。其余3组比例处理下能产生颉颃作用但效果不佳。此外枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的颉颃作用在8～12 h最为明显，12 h后枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的颉颃作用逐渐减缓。

表2 24 h时枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的生长情况Tab.2 Growth of V.parahaemolyticus and B.subtilis after 24 hours

2.3 琼脂扩散法

培养60 h结束后，各比例浓度滤纸片处理后显示枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌有明显的颉颃作用（图5）。总体来看，枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的颉颃作用与浓度比程正比，且当枯草芽孢杆菌与副溶血弧菌的浓度比大于0.1时即会产生明显抑菌圈，但是若副溶血弧菌处于高水平浓度时，两者浓度比需大于等于1才能产生稳定持久的抑制作用。此外0～12 h枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌产生颉颃作用最为明显，12～24 h，24～36 h产生的颉颃作用逐渐削弱，36 h以后保持平稳不变。其中有5组试验比例在36 h前枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌有颉颃作用，而后36 h其的颉颃作用几乎消失，分析显示杆菌浓度过低会导致抑菌圈内的杆菌被弧菌竞争性抑制而导致颉颃效果降低。

2.4 对平板抑菌圈的物质探究

通过对抑菌圈里的物质取样，革兰氏染色与显微观察，证实抑菌圈内部的细菌是枯草芽孢杆菌，进一步支持枯草芽孢杆菌可有效抑制副溶血弧菌的结论。

图3 液体竞争培养中不同时间枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的抑制率Fig.3 In liquid competitive the changes of V.parahaemolyticus by B.subtilis over time

图4 平板试验中不同时间枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的抑制率Fig.4 In the table experiment B.subtilis inhibition rate against V.parahaemolyticus at different times

3 讨论

在枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的颉颃培养下，枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌生长的抑制较为明显，同时还发现随着杆菌浓度比的增加，杆菌对弧菌的颉颃作用也随之增加。先前有研究表明枯草芽孢杆菌可以抑制许多致病菌，如秦瑶等[11]的研究结果显示枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌和沙门氏菌有抑菌作用，陈莉等[12]的研究结果显示枯草芽孢杆菌N1729对棉花病原菌、枯萎病菌和黄萎病菌有抑菌作用。而本文实验结果得出枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌亦有较强的颉颃作用，可抑制其生长，也证明吴耀华[13]在南美白对虾早死综合征防控中提出将枯草芽孢杆菌作为解毒制剂的措施是可行的。

而目前对于枯草芽孢杆菌使用时最适宜抑菌浓度及投放量的研究较少。市售有很多枯草芽孢杆菌的产品，但对其用药量和用药频率并没有详细的说明，很多研究也没有跟踪监测枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌不同浓度培养下随时间的动态变化。本文采用琼脂扩散法和液态培养法动态跟踪监测不同浓度下枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的颉颃作用，琼脂扩散试验法中发现杆菌与弧菌浓度比为0.1时就能产生明显的抑菌圈，但抑菌率始终维持在较低的数值，且36 h后抑菌圈内杆菌将逐渐被弧菌竞争性抑制使得抑菌圈逐渐变小；液态颉颃培养法中显示当杆菌与弧菌浓度比大于等于1时，24 h后抑菌率稳定维持80%以上。当浓度比达100时抑制率最高，作用时间最短；黄汝添等[14]从枯草芽孢杆菌（Bs-1）中分离出对副溶血弧菌的有抑制效果的抗菌物质，每升海水中加入4 mL该物质（4×106CFU/mL）对浓度为104CFU/mL的副溶血弧菌有抑菌效果；而本文研究结果显示在不提取抗菌物质的前提下，1：1的浓度比已能达到良好的抑菌效果，100：1的浓度比可在短时间内完全抑制弧菌生长。

本实验在得出枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌有明显颉颃作用的基础上，从不同浓度比例和时间维度上分析枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的抑制特点，对于副溶血弧菌爆发时的病原浓度不同、处理时间不同，应采用不同的浓度比。通过实验看出当枯草芽孢杆菌与副溶血弧菌的比例为100：1时，枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的颉颃作用最为明显，4 h时培养液中就检测不到副溶血弧菌；比例为50：1时8 h时培养液中就检测不到副溶血弧菌；比例为10：1时，24 h后仍能保持88%以上的抑菌率；比例大于等于1时，枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的颉颃作用明显；比例小于1时，会产生颉颃作用但效果不稳定。综上结果表明，基于对枯草芽孢杆菌添加成本的考虑，不同时段枯草芽孢杆菌最适使用浓度不同。4 h内投放枯草芽孢杆菌最适浓度比为50：1；8 h内投放最适浓度比为10：1；8 h后间歇性投放浓度比为1：1的枯草芽孢杆菌。

该研究通过跟踪监测枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌不同浓度比的拮抗作用，寻找到一种较为合适的用药浓度和用药频率，为减少抗生素在水产养殖防控弧菌中的使用提供了可行的途径。

图5 抑菌圈内菌种革兰氏染色观察Fig.5 Gram staining of strains in the inhibition zone