数字PCR技术研究进展

李智杰，刘占悝，李健友，刘泽余，郭利※

（1.中国农业科学院特产研究所农业部经济动物疫病重点实验室，长春 130112；2.吉林农业大学，长春 130118）

数字PCR（Digital PCR）是于20 世纪由Vogelstein等[1]提出的用于核酸分子定量精密检测的一种方法。它是将稀释后的核酸模板分配到大量不同的反应单元中，使每个反应单元中有一个或没有核酸。利用PCR扩增的同时，加入可检测荧光。待扩增结束时，使用泊松分布统计学方法采集每个反应单元出现的荧光次数，从而定量检测样本中的核酸浓度。由于数字PCR采取先扩增后定量，因此不依赖于扩增曲线的循环阈值，也不需要制备标准曲线。具有准确度高、可以定量分析的优点。

1 数字PCR原理

数字PCR 是PCR 扩增和荧光信号采集两个部分先后交替进行。它的关键是模板的稀释。通过将模板大量稀释，尽可能使反应单元中只存在1 个或没有模板，在每次PCR 扩增后，对每个反应单元进行荧光信号计数。出现荧光的反应单元计数为1，没出现荧光信号的计数为0。理论上，每个反应单元中的模板数为1 个或0 个，但是实际操作中，很难做到这点，因此就需要应用泊松分布公式来计算样本初浓度[1]。数字PCR 采用的是终点检测荧光数量，不依赖扩增曲线的循环阈值，也不需要制备标准曲线，受PCR 扩增效率的影响较小，且对PCR 反应抑制物的耐受能力高，数据精密、准确[2]。

2 数字PCR的分类

数字PCR 从概念提出到商业化生产在短短几十年间经历了飞速发展。根据分液方式的不同，数字PCR主要分为微孔板数字PCR、微滴数字PCR以及芯片数字PCR。最初，分配分子模板是在96/384 孔微孔板中进行[1，3]，面对复杂的样品仍采用手动稀释加样方法，会带来巨大加样误差。由于数字PCR 技术的准确程度取决于反映单元的总数，即反映单元数目越多，越有利于数字PCR 的准确度。因此，96/384 孔板也无法满足反应需要。

随着自动化系统水平日渐完善，在过去的10年中，不同公司正在探索不同的技术和方法来实现数字PCR 自动化。目前，可用的数字平台在分液数量、液滴生成方法以及所需专用设备方面有所不同。BioMarkTMHD系统提供专用于数字集成流体回路（IFCs）的矩阵，可将样品分配在多个单独的反应室中；QuantStudio 3D系统采用硅芯片，该硅芯片由单个反应孔按一定顺序排列组成，可使样品按其矩阵进行分配；CONSTELLATION数字PCR 系统采用微孔板，通过利用密封的压缩轴形成微管将样本液体通道分离成单独的微流体室；其他数字PCR 平台，如QX200TMDropletDigitalTMPCR 和RainDropplusTM数字PCR 系统使用油包水乳化进行分区，水相由引物、探针或荧光染料组成并混合成超预混合物，样品和矿物油则装入专门设计的支架中，液滴发生器使用微流体产生压力，将水相和油相吸入输出通道，在此过程中形成液滴，每个液滴在特定的液滴读取器中逐一读取；来自Stilla TechnologieTM公司的Naica 系统就是结合了阵列和乳化这两种方法，在这个系统中，样品通过芯片的通道并在芯片内部形成液滴，成为较为理想的数字PCR 技术平台。

3 数字PCR的检测方法

与荧光定量PCR 相似，数字PCR 主要使用核酸分子染料和水解探针这两种方式来检测核酸[4]。这两种检测方法都会得到与核酸量成比例的荧光信号。核酸分子染料插入双链DNA，并与双链DNA 相互作用后，呈现激发态，产生强烈的荧光。核酸分子染料是非特异性的，无论DNA分子序列如何，都可以与其相互作用。相比之下，水解探针与序列结合是特异性的。荧光标记的寡核苷酸探针在与靶序列杂交后可以被DNA聚合酶的5'至3'端外切核酸酶切割，此时，位于寡核苷酸探针5'末端的荧光报告染料就被释放并产生荧光信号。

4 数字PCR的风险与优势

4.1 假阳性

目前，所有的数字PCR平台都会受到污染及其带来的假阳性结果[5-10]。Kiselinova 等[8]在测定HIV-1RNA的阴性对照的3个孔中仍然检测到阳性液滴（0.16～0.22拷贝/反应）。经查证后发现，这些液滴与患者样品中的真正阳性液滴具有相似的荧光强度。这些假阳性现象出现的原因仍不清楚，人们对此提出了各种假设。错误的阳性结果可能来自不良的检测设计或由于PCR循环数量较多而检测到其他非目的条带。另外，假阳性液滴可能由污染物或混合在一起时的液滴产生，它们的相互作用形成具有较高亮度荧光液滴，导致假阳性荧光出现。

4.2 优势

除了假阳性问题之外，数字PCR在很多方面与荧光定量PCR 结果相同或更好。这两种PCR 之间的主要区别是其对于测量靶序列数量的方法不同。在荧光定量PCR整个扩增过程中都有监测反应，并且定量是基于指数阶段荧光信号的分析。数字PCR 是通过终点测量收集荧光信号，并使用总量上的阳性分区数来倒推出目标浓度。数字PCR 不依赖于校准曲线进行样品定量，避免了与反应效率变化相关的缺陷[11]。数字PCR是对核酸进行绝对定量的一种方法，依赖于终点荧光信号的检测和两点分布（反应中荧光的不存在或存在）[12]。用于执行样品分配以及单个分子扩增的数字PCR 理论上优于荧光定量PCR。但实际上，在已经发表的文章中显示，荧光定量PCR平台具有更高的敏感性，这可能与样品量有关[13-14]。在连接目的DNA双链的数字PCR 实验中，观察到少数分区，在2 个反应孔中只有1 个孔显示扩增[15]。造成这种结果是因为DNA 连接酶和目标模板结合后的钝性分离还是真正的扩增失败，现在仍然不清楚。推测原因可能是存在特异性模板扩增抑制剂，模板降解或有三级结构。此外，如果真的不能扩增，目前还不清楚是否仅与使用数字PCR 有关，还是在荧光定量PCR 的情况下是也存在类似的机制。

5 数字PCR技术应用

数字PCR以其极高的灵敏度主要应用于疾病检测诊断和微生物检测分析上。

5.1 疾病诊断

Furuya D 等[16]使用QuantStudio 3D 数字PCR 检测到Wilms tumor 1（WT1）因子在造血系统肿瘤中过表达。结果与实时荧光定量PCR 进行对比后发现，实验结果相关性非常强（R=0.99）。但数字PCR 能够准确检测至更低的WT1 含量，可用于准确预测WT1/ABL1 的表达水平，因此，可用于诊断或评价白血病患者的药物效率。

5.2 细菌活菌计数

使用平板计数来统计益生菌数量是目前较为普遍的细菌计数方法，但该方法实验时间长，不能区分细菌菌株。Hansen SJZ 等[17]使用基于芯片的数字PCR 来检测双歧杆菌属的亚种，利用不同基因序列设计引物和探针，使用单丙酰叠氮预处理以防止误扩增死亡的益生菌DNA，使用玻璃珠震荡破碎细菌，使DNA 从具有完整膜的细胞中释放。该优化的测定法都能成功地检测每个菌株。芯片数字PCR 方法对于乳酸菌Bl-04 和嗜酸乳杆菌NCFM分别具有4%和5%的相对标准偏差，比平板计数更精确。由于其准确性、应变特异性和在数小时内就可以获得结果的优点，使得数字PCR 有可能取代传统的平板计数。

5.3 噬菌体研究

目前，噬菌体的研究方法很少，原因是噬菌体可培养性的限制以及通用的基因标记的缺乏。Morella NM等[18]运用液滴数字PCR 检测到丁香假单胞菌和针对其捕食的两种噬菌体在使用培养基共培养和番茄感染过程中，随时间推移，噬菌体跟踪细菌过程和噬菌体的密度，比较噬菌体附着率，并探索噬菌体-噬菌体竞争动态。结果证明，液滴数字PCR 可研究菌体内、外细菌-噬菌体动力学。使用液滴数字PCR 方法与更传统的噬菌斑形成单位（PFU）的计数结果相同，但使用数字PCR能更快得出结果，更低的浪费和更高通量的研究噬菌体与细菌相互作用的方式，使得数字PCR将成为噬菌体研究中的一种新的有价值的工具。

5.4 癌症的早期研究

循环肿瘤DNA（ctDNA）是活肿瘤细胞释放的DNA，半衰期约为1.5h。对循环肿瘤DNA 进行及时监测分析，不仅有利于早期发现癌症，还能监测癌症复发情况，这对癌症患者的发病率和死亡率产生重大影响。与肿瘤组织活检相比，血液循环肿瘤DNA 分析具有微创性，可以定期随访癌症患者监测癌症。然而，使用ctDNA进行早期癌症诊断也并不容易，因为血液中存在的肿瘤DNA 的量较少，并且肿瘤DNA 会被源自非肿瘤细胞的DNA 稀释。基于液滴的数字PCR 等新技术的开发大大提高了检测稀有序列的灵敏度、特异性和精确度，为癌症的早期研究和诊断奠定基础[19]。

6 展望

数字PCR 作为一种新兴技术，与荧光定量PCR等定量分析的PCR技术相比，具有非常高的准确性和灵敏度。数字PCR 在核酸检测定量、抗病毒治疗监测、预后判断具有重要的意义。它的出现，为研究者提供新的检测方法和实验思路。但从实际操作角度来说，数字PCR 的实验设备费用高昂、实验操作复杂这些还不足以完全取代荧光定量PCR。此外，由于检测癌症或者肿瘤是依靠检测血液中的癌症标记物而进行的，但是癌症或者肿瘤释放的可用于检测的生物标记物是随机的，因此，如何选择相应的标记物来预测癌症还需要进行大量研究。其次，由于数字PCR 灵敏度非常高，对于诊断未知和复杂的案例可能会出现假阳性，因此，还需要结合案例的实际情况加以判断。对于检测稀有核酸种类样本，可能存在抽样偏差，导致待分析的目的基因片段未出现在取样样本中，从而导致假阴性出现。相信随着数字PCR 技术的发展和商品化程度的提高，数字PCR 的诊断会更加正确，通量将会更高，成本更低，未来在科学研究领域将会发挥更重要的作用。