氨基糖苷类抗生素联合用药对MDR-Ab的体外的药敏研究
2019-01-12汪璟璇王艺颖赵行健高天宇艾阳陆思静
汪璟璇，王艺颖，赵行健，高天宇，艾阳，陆思静
(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)
鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii ,Ab)为非发酵需氧革兰阴性杆菌，属于莫拉菌科[1]，为院内感染机会致病菌，可引发菌血症、肺炎、泌尿系统感染、脑膜炎等[2]。随着抗菌药物的使用，诱导细菌耐药性增强，近年来多重耐药鲍曼不动杆菌(multi-drug resistance Ab，MDR-AB)在临床分离菌中检出率维持在高水平，甚至泛耐药鲍曼不动杆菌(X-drug resistant XDR-AB)及全耐药菌株(Pan-drug resistant PDR-AB)均被检出，可见当前耐药形势极为严峻。氨基糖苷类因其不良反应，临床较少应用于老年及儿童这一群体，但随着硫酸依替米星等新一代药物问世，氨基糖苷类的应用机率增加。已知目前氨基糖苷类为主与其他抗菌药物联较合方面的研究较少，本实验选用氨基糖苷类中的三种抗菌药物——硫酸依替米星、阿米卡星和庆大霉素分别与头孢哌酮/舒巴坦、多黏菌素B、替加环素、美罗培南和哌拉西林/舒巴坦联合，以探究体外联合的最佳方案。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株来源
实验菌株为2016年11月至2017年9月锦州医科大学附属第一医院呼吸二病区临床送检标本中分离的不重复的MDR-AB 35株。
1.1.2 抗菌药物
头孢哌酮/舒巴坦1.5 g(1∶1) (大连辉瑞制药有限公司，国药准字H20020597)、美罗培南(住友制药有限公司，国药准字J20140169)、庆大霉素(国药集团容生制药有限公司，国药准字H41020609)、阿米卡星(齐鲁制药有限公司，国药准字H37020562)、依替米星(常州方圆制药有限公司，国药准字H20020129)、多黏菌素B(SIGMA公司，批号1222536)、替加环素(海正药业，国药准字H20123339)、哌拉西林/舒巴坦2.5 g(4∶1) (哈药集团制药总厂，国药准字H20051178)。
1.1.3 培养基
Muller-Hinton(MH)肉汤(上海万疆生物技术有限公司)、琼脂粉(天津市致远化学有限公司)
1.1.4 实验设备
MDF-192(N)-80 ℃超低温冰箱(Sanyo公司)、MBR-506D(H)4 ℃冰箱(Sanyo公司)、DHP060 恒温培养箱 (上海实验仪器厂)、360ES-A电子天平[普利赛斯国际贸易(上海)有限公司]、SW-CJ超净工作台(苏州净化设备有限公司)、WGZ-XT比浊仪(杭州大吉光电仪器有限公司)。
表1 抗菌素名称及起始浓度
1.2 实验方法
1.2.1 菌株鉴定和药敏实验
用美国Microscan Walk Away 40 全自动微生物鉴定系统对菌株进行鉴定。
1.2.2 微量肉汤稀释法
采用96-孔板微量肉汤稀释法测定选用的8种抗生素单药MIC值。配好抗生素母液，设定起始药物浓度，倍比稀释到最低共11个浓度梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512以及1∶1 024)。采用棋盘法进行联合药敏试验，将药物两两组合加入96孔平板中。记录两药联合应用时各自的MIC甲药联用和MIC乙药联用，以计算FIC指数，即部分抑菌浓度指数，FIC指数=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用。
1.2.3 联合效应判读标准[16]
FICI≤0.5，协同作用；0.5
1.2.4 统计学方法
2 结 果
35株MDR-AB均对头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南、哌拉西林/舒巴坦、硫酸依替米星全耐药，阿米卡星耐药率97.1%，庆大霉素耐药率68.6%，替加环素耐药率为22.9%，多黏菌素B耐药率14.3%。其中多黏菌素B敏感率最高，替加环素、庆大霉素、阿米卡星次之，见表2。
硫酸依替米星单药及联合后的MIC范围、MIC90见表3所示，可知硫酸依替米星与哌拉西林/舒巴坦联合后，MIC90降为单药时的1/16；与多黏菌素B、替加环素联合后，MIC90降为单药的1/2。与头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南联合后，MIC90升为原来2倍。
表2 35株MDR-AB药敏结果
注：CPS为头孢哌酮/舒巴坦；MEM为美罗培南，PIS哌拉西林/舒巴坦，ETM为硫酸依替米星，AMK为阿米卡星，GM为庆大霉素，TGC为替加环素，PLB为多黏菌素B
表3 硫酸依替米星及联合5种抗生素的单药及联合用药对35株MDR-AB 的MIC范围、MIC90的比较
注：MIC范围:抑制细菌生长所需药物的最低浓度范围；MIC90:抑制90%细菌生长MIC值
如图1所示，硫酸依替米星与哌拉西林/舒巴坦联合后，浓度-累计抑菌百分率曲线左移最为显著，替加环素、多黏菌素B次之。
阿米卡星单药及联合后的MIC范围、MIC90见表4所示，可知阿米卡星与多黏菌素B、替加环素联合后，MIC90降为单药的1/4。与头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南联合后，MIC90升为原来2倍。
如图2所示，阿米卡星与替加环素、多黏菌素B联合后，浓度-累计抑菌百分率曲线左移。
庆大霉素单药及联合后的MIC范围、MIC90见表5所示，可知庆大霉素与多黏菌素B联合后，MIC90降为单药的1/8；与替加环素联合后，MIC90降为单药的1/4；与头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南联合后，MIC90升为原来2倍。
如图3所示，庆大霉素与替加环素、多黏菌素B联合后，浓度-累计抑菌百分率曲线左移。
硫酸依替米星与哌拉西林/舒巴坦、替加环素、多黏菌素B联合，FIC指数大多分布在小于等于1的范围内，主要呈协同和相加作用；与头孢哌酮舒巴坦、美罗培南联合，FIC指数大多分布在1至2范围内，主要呈无相关和拮抗作用，见表6。
表4 阿米卡星及联合4种抗生素的单药及联合用药对35株MDR-AB的MIC范围、MIC90的比较
表5 庆大霉素及联合4种抗菌素的单药及联合用药对35株MDR-AB 的MIC范围、MIC90的比较
表6 硫酸依替米星与5种药物组合FIC指数构成比(%)
注：X2=110.758，P=0.000
FIC≤0.5，协同作用；0.5
阿米卡星与多黏菌素B、替加环素联合，FIC指数大多分布在小于等于1的范围内，主要呈协同和相加作用；与头孢哌酮舒巴坦、美罗培南联合，FIC指数大多分布在1至2范围内，主要呈无相关和拮抗作用，见表7。
庆大霉素与多黏菌素B、替加环素联合，FIC指数大多分布在小于等于1的范围内，主要呈协同和相加作用；与头孢哌酮舒巴坦、美罗培南联合，FIC指数大多分布在1至2范围内，主要呈无相关和拮抗作用，见表8。
表7 阿米卡星与4种药物组合FIC指数构成比(%)
注：χ2=101.881，P=0.000
表8 庆大霉素与4种药物组合FIC指数构成比(%)
注：χ2=60.632，P=0.000
3 讨 论
鲍曼不动杆菌为21世纪重要的临床致病茵，可引发菌血症、肺炎、泌尿系统感染、脑膜炎等，其中主要为呼吸道感染，并可从痰液、全血、创口分泌物、尿液、脓液或胸水、腹水中检出，本实验标本均来源于呼吸内科，与文献报道相符[17]。根据最新CHINET[3]显示，该菌在临床分离株中检出率为10.77%，与2015年[4]基本持平。在最新CHINET[3]481-491中，阿米卡星、庆大霉素、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率分别为50.5%、63.3%、43%、71.4%，本实验中上述药物耐药率高达68%以上，与最新监测结果相符。
氨基糖苷类抗生素主要通过与核糖体30s亚基16srRNA结合抑制细菌蛋白质生成达到抑菌目的[5]。由于其耳毒性、肾毒性，氨基糖苷类药物在临床应用中受到限制[6]，其中硫酸依替米星属于半合成水溶性氨基糖苷类抗生素，与前代氨基糖苷抗生素相比耳毒性、肾毒性、神经肌肉麻痹、变态反应等不良反应的发生率均已显著降低[7]，硫酸依替米星已在临床老年人抗感染治疗中应用，并获得较良好的疗效[8]。本实验中硫酸依替米星与哌拉西林/舒巴坦联合效果较佳，考虑可能原因为哌拉西林为青霉素类抗生素，主要作用于细菌菌体内的青霉素结合蛋白(PBPs)，抑制细菌细胞壁合成，并借助细菌自溶酶使其溶解产生抗菌作用；依替米星抑菌机制为作用于核糖体影响蛋白生成，两者结合可能是哌拉西林/舒巴坦通过抑制细菌细胞壁合成使其失去渗透屏障，使硫酸依替米星易于与核糖体30SrRNA结合达到抗菌目的，同时哌拉西林/舒巴坦是复合制剂，舒巴坦可保护β-内酰胺酶不被水解[9]。
3种氨基糖苷类抗生素与多黏菌素B联合均呈现较好效果。多黏菌素B作为专家共识[10]提出的治疗MDR-AB感染的重要药物，其主要作用机制为破坏细菌的胞质膜，使胞质外漏，影响核糖体与细胞核功能[11],这一特点促使细菌不易对其耐药。氨基糖苷类抗生素与其联合后，多黏菌素B可能使细胞膜遭到破坏，利于氨基糖苷类抗生素进入并与核糖体蛋白结合，产生抗菌效果。
替加环素作为另一种治疗MDR-AB感染的药物，这3种氨基糖苷类抗生素与之联合也呈现较高协同率。替加环素可通过与核糖体30S亚基结合，阻断转运核糖核酸进入核糖体A位点，进而抑制氨基酸残基肽链形成，阻断蛋白翻译，而抑制细菌蛋白形成[12]。而氨基糖苷类耐药机制中有产生氨基糖苷类修饰酶[13]，通过与替加环素联合，可能为替加环素阻断蛋白翻译过程，干扰了细菌产生修饰酶，从而解除了氨基糖苷类的耐药性，使得这3种氨基糖苷类药物与替加环素联合效果较好。
本实验中这3种氨基糖苷类药物与美罗培南联合呈拮抗作用，考虑可能与AB对这两类药物的耐药机制中外排泵有关。AdeABC为鲍曼不动杆菌所特有的外排系统，该系统中存在一个由 AdeA、AdeB 和 AdeC 组成的三联体结构。所有鲍曼不动杆菌均可扩增出药物外排泵基因adeB,其中AdeA、AdeC 共同形成的三聚体外排结构，参与对氨基糖苷类与碳青霉烯类等多种药物的外排[14]。细菌通过外排系统可能将美罗培南及这3种氨基糖苷类药物排出菌体外，从而使得美罗培南与这3种药物联合效果不佳。
此外实验中的3种氨基糖苷类抗生素与头孢哌酮/舒巴坦联合拮抗率较高，推测可能与AB的耐药机制中的超广谱-内酰胺酶有关。其中PER-1型β-内酰胺酶除可水解头孢哌酮舒巴坦外，还可水解阿米卡星、庆大霉素等氨基糖苷类药物[15-17]。
在本研究中，硫酸依替米星与哌拉西林/舒巴坦、多黏菌素B或替加环素联合应用取得较好效果，其协同率分别为48.5%、42.9%和37.1%。其次为阿米卡星与多黏菌素B、庆大霉素与多黏菌素B联合应用，其协同率均为34.3%，以上结果均可为临床联合应用抗菌药物治疗多重耐药鲍曼不动杆菌提供新的方案。
本实验着重于探究氨基糖苷类抗生素与其他抗菌药物的体外联合用药效果，体内效果待完善后续研究加以补充。
(此文图1-3见附页5)
