影响马精液冷冻保存效率的因素分析

汤 驰，段洪云，邓 亮*，韩国才

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.幽兰医疗健康有限公司，广东深圳 518000；3.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

自1957 年首次利用冻精输精使母马妊娠并获得了幼驹[1]后，人们对马精液冷冻保存技术的研究从未间断过，但保存效果没有实现很大的突破，冻精使用也未完全普及。长期以来，马冻精的操作方法、稀释液的选择等都存在较大差异[2]，尚未形成统一的冷冻操作技术方法，缺乏直接有效的评估冻精制作效果的标准。影响马精液冷冻保存效率的因素主要包括冻精稀释液的种类、不同抗冻剂的使用、离心过程和平衡温度的选择等，目前尚未确定一套完整的标准。近年来，随着我国现代马产业不断升温，对冷冻精液的研发和使用需求逐步增加[3-4]，如何在精液冷冻保存过程中降低精子死亡率是面临的首要问题。本文综述马精液冷冻保存过程中精子死亡的影响因素，以期为提高马精液冷冻保存效率、促进我国马产业更快发展提供一定的理论依据。

1 精 清

主要来源于副性腺的精清为精子的保护和运输提供重要帮助，如前列腺含有较多的蛋白质、柠檬酸、锌，可以让精子提前成熟。精清为精子提供合适的渗透压、pH，防止过氧化作用[5-6]。但精液射出后精清中的某些物质会使得精子提前获能从而缩短精子存活时间，导致受胎率下降。另外，精清中的氯化钠以及磷脂酶的水平直接影响降温和冷冻时精子的存活[7-8]。人们希望通过去除精清中的有害物质保留对精液冷冻保存有益成分，从而达到最佳的冷冻保存效果[7,9]，但目前精清中对精子有害的成分尚未研究透彻，其机理还不够明确。

为了减少精清的毒害作用，在采精后需要去除精液中体积占比为5%～10%的精清，以500 ×g 离心10 min效果较佳[10]。采用单层梯度离心技术能够有效提高冷冻-解冻后马精子的质量[11-12]。但若离心过程中离心力、离心时间和离心稀释液等条件选择不合适，将造成精子的大量死亡。在离心管底部加入瑞典沙克等缓冲液以及使用奶嘴式离心管，可以减少离心时精子在离心管底部因堆积造成的死亡[13]。

2 抗冻剂

在精液的冷冻保存中，抗冻剂是不可或缺的物质之一，抗冻剂通过降低水的冰点值从而起到保护精子的作用。抗冻剂包括渗透性和非渗透性抗冻剂，渗透性抗冻剂又分为甘油类和酰胺类，理想的抗冻剂应该具有易溶、分子量小、毒性弱等特点。目前，甘油在精液的冷冻保存技术中应用最为广泛，但甘油对精子具有一定毒性。甘油会导致精子的蛋白质分解、改变顶体反应、引起细胞膜囊泡化[14]；甘油会影响细胞质膜的通透性以及生物能量的平衡性，改变胞内微管蛋白和微丝蛋白以及胞质糖蛋白的功能[15]。Macedo 等[16]研究发现，甘油慢速穿过细胞质膜会增加其毒性作用。胺类和酰胺类物质作为马精液冷冻保存抗冻剂的研究较为深入，主要涉及到甲酰胺、乙酰胺、甲基乙酰胺、二甲胺、二乙基甲酰胺、二甲基乙二胺、二甲基甲酰胺等不同物质的选择及混合使用等[17]。胺类和酰胺类物质分子量较小，对精子的渗透压影响较小，穿透精子膜的速度也较快，对精子造成的毒性较小[18]。Melo 等[19]分析发现，二甲胺、甘油和二甲基甲酰胺在解冻后对公马精子活力影响无显著差异，但二甲胺组的精子质膜完整性比甘油组更好。Santiani 等[20]比较二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、甘油对秘鲁帕索马精液的抗冻保护能力，发现二甲基乙二胺效果最佳。

抗冻剂对精子的保护作用主要是由于抗冻剂所含的羟乙基中孤电子对的数量能够形成氢键，使细胞脱水或者吸收细胞内的水，从而使冰点值下降；另外，加入抗冻剂后溶液的浓度升高使稀释倍数增大，冰点值也会下降，从而达到保护精子的目的[21]。

3 微生物

公马阴茎和包皮内有多种长驻微生物菌落，因此精液在采集后会携带许多微生物，且精液处理过程中使用的仪器设备、稀释液等都含有一定的微生物。精液中某些微生物的抗冻能力很强，其不仅会直接抑制常温下精子的存活，也会影响冷冻精液的质量，有些甚至还会直接引发母马生殖道疾病。精液中较为常见的微生物有肺炎杆菌和绿脓杆菌[22]。

在马精液稀释液中加入适量抗生素是抑制微生物的较为理想的方法。在精液冷冻保存中使用较多的抗生素有青霉素（盐类）、链霉素（盐类）、庆大霉素、阿米卡星、多粘菌素B 等[23]，但庆大霉素、阿米卡星加入到稀释液后会直接影响稀释液pH，不利于精子存活，此外pH 改变会使得以奶油为基础的稀释液凝结。庆大霉素和粘菌素等抗生素会抑制精子的运动，所以需要在稀释液中合理添加抗生素[5]。

4 过氧化作用

正常情况下，精液中具有活性氧的生成和清除系统，二者处于动态平衡过程，而马精液在制作成冻精时，体外处理时间较长容易产生活性氧[24]。在采集的精液中，精子死亡后便开始产生活性氧，死精中芳香化氨基酸在芳香化氨基酸酶的作用下降解产生过氧化物质。精液中生成的活性氧过多或精子的清除能力下降时，活性氧就易诱发精子质膜多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应生成大量脂质过氧化物（LPO）[25]，导致精子运动力下降、质膜完整性丧失，从而出现精子提前获能、顶体反应和超活化现象，降低母马受胎率。另外，精子DNA 包括线粒体DNA 链的断裂与过氧化作用也密切相关。合适的过氧化作用可以促进精子获能从而提高受胎率，大量的过氧化物产生虽然仍然能够完成受精，但是会使得精子DNA 不完整，如发生碱基异位、碱基改变等，造成后代发生某些遗传病[26]。

精液中存在抗氧化的酶类和非酶类物质，构成活性氧清除系统。抗氧化的酶类物质包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等[27]；另外麦角硫因、谷胱甘肽、维生素、硒等非酶类物质也具有一定的抗氧化作用。这些活性氧物质之间相互协同，共同保护精子免受活性氧损伤。其机理主要分为3 个阶段：第一阶段为谷胱甘肽酶、超氧化歧化酶等抗氧化酶和金属离子结合去除自由基；第二阶段为维生素A、维生素E、谷胱甘肽等非酶类物质结合谷胱甘肽酶类物质共同清除过氧化物；第三阶段为多种酶共同作用，修复及清除损伤的细胞表面分子和质膜[28]。Franco 等[29]比较了添加α-生育酚与无抗过氧化剂条件下马精液冷冻的效果，结果证明α-生育酚可显著降低低温保存对精子的氧化应激和脂质过氧化作用。Wu 等[30]研究发现，多种抗过氧化剂联用比使用单一抗过氧化剂对马精液冷冻保存的效果更好。

5 渗透压

精子表面膜上的脂类物质一般包括70%的磷脂、25%的中性脂类和5%的糖脂，但不同动物精子表面膜的组成存在一定差异[31]。精子质膜脂类物质的组成与精子降温时抗冷打击能力存在一定的相关性，即质膜中胆固醇与磷脂之比越大，精子的抗冷打击能力越强，另外饱和的磷脂酰类含量越多抗冷打击能力也越强[32]。马的精子质膜中胆固醇与磷脂之比与牛、羊等家畜不同，因此精子对低温的敏感性程度存在差异[33]。

温度降低时，精子质膜会从液态变为凝胶状，发生相位转变时的温度为17～34℃。不同的磷脂组成发生相位变化时的温度也不同，月桂酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸等碳链短而不饱和的脂类其相变温度在10～15℃，胆固醇、糖脂、鞘磷脂等碳链长而饱和的脂类相变温度为30～40℃。马的精子质膜中含有较多的月桂酸和花生四烯酸，因此其相变温度较低，精子也具有较强的抗冷打击能力[34]。

人、牛和羊的精子体积约为20～28 μm3，马精子体积约为25 μm3[35]。精子的等渗透压为300 mosm/kg，马精液在冷冻过程中精子受到的渗透压改变主要来自2 个方面：第一，稀释液，包括离心时的稀释液和抗冻稀释液。通过使用不同渗透压的台式液（TALP）研究对马精子的影响，发现高渗溶液和低渗溶液中精子的活力、顶体完整率、线粒体完整率都有所下降，但是高渗溶液较低渗溶液的影响要小，且不论高渗或者低渗溶液，当精子重新等渗时精子的体积不少于原先的0.707 8[36]。第二，温度的变化，包括冷冻和解冻过程的温度变化。冷冻时精子表面的水先结晶导致精子周围的渗透压增大，精子脱水，解冻时精子因吸水而膨胀，均会对精子造成一定的影响[37]。通过冷冻过程中精子的生物物理及生物化学现象来度量渗透压对精子的损害程度，在温度不变情况下，可以得出公式Vi=（M0/Mi）×（V0＋Vb）+ Vb，其 中V0、M0、Mi、Vb、Vi分 别 代 表 精 子 等渗体积、等渗压、非等渗压、重新等渗的体积和细胞非等渗体积，根据该公式可以选择合适的稀释液渗透压。然而，精子所能承受的渗透压与精子基因、温度、水的穿透性、冷冻剂以及冰晶的形成都有关系，所以必须综合考虑各方面的因素才能更有效地减少渗透压对精子的损害[38]。

6 冷冻和解冻

精液冷冻保存时需要经历降温的阶段，快速降温和慢速降温都会对精子造成一定的损害。快速降温，细胞核内的水分来不及流出，水分将滞留在细胞内形成冰晶损害细胞。慢速降温，细胞外的水开始结晶，细胞外的渗透压升高，细胞逐渐脱水，体积减小，而且慢速降温时间比较长，细胞一直处于高渗溶液中会受到损害[39]。因此降温速率一定要合适，才能最大程度减少化学性和渗透性伤害。

冻精的解冻过程也是造成精子死亡的重要因素之一，不合适的解冻方法会直接导致细胞死亡。冻精的解冻相当于冷冻的逆过程，解冻时复温的速率非常重要。一般来说越快越好，慢速复温会使得细胞内重新生成冰晶损害细胞。目前较为常见的马冻精解冻方法包括37℃解冻30 s、46℃解冻20 s、75℃解冻7 s，这些方法都可以得到较好的冻后精液活力[40]。

7 小 结

精液冷冻保存是马人工辅助繁殖技术之一，对促进我国现代马产业的发展有着重要作用。目前我国对于马精液冷冻保存技术的应用和推广还不广泛，对于马精液冷冻保存时造成精子大部分死亡的因素尚未揭示清楚。因此，需要进一步深入研究精液在冷冻过程中经历的生物物理和生物化学变化，以寻求相应的技术手段为改进马精液的冷冻保存效果提供可靠的理论依据。