益生菌中乳酸菌概况及检测技术的研究进展

周莉，平洋，谭静，张亚勋，罗蓓蓓

(河南省商业科学研究所有限责任公司，郑州 450002)

1 益生菌概述

益生菌(probiotics)的概念最早源于希腊语，意为“对生命有益”。2001年，联合国粮农组织和世界卫生组织将益生菌定义为“当活性微生物足量且给予宿主健康益处”。但是由于“健康益处”这一概念太过于模糊，世界卫生组织将其进一步补充为“对主体的益处必须实现，并且被证明超过安慰补偿剂的范围”[1]。益生菌是指通过改善人类肠道菌群进而改善人体健康状况的一类活菌，但不是所有的有益菌都称得上是益生菌，要想成为益生菌需符合以下条件：能够耐受胃液、胆汁的腐蚀；在肠内是存活状态且能增殖；能够改善肠内菌群；保证安全性；活菌状态且含一定菌数；经济实惠且容易处理[2]。益生菌不仅具有改善食品风味，延长食品保质期，提高食品营养价值的功能，而且其还具有调节胃肠道菌群正常和维持人体肠道卫生平衡的功能[3]。益生菌在益生菌饮品、益生菌制剂和膳食添加剂中应用广泛，如益生菌饮料乳制品和益生菌胶囊等。

1.1 益生菌中乳酸菌概述

对于益生菌的研究，越来越多的学者将各种食品与益生菌结合起来，将益生菌添加到不同食物中进行研究[4，5]。在所有益生菌中, 目前研究得最深入、最受重视的一类当属乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB), 乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。它是一种有利于机体健康的微生物，革兰氏阳性杆菌或球菌,获得能量的方式是发酵碳水化合物,从而产生乳酸。它不仅能够调节肠道菌群平衡,并产生抑菌代谢产物，抑制腐败菌的生长。并通过与腐败菌竞争生长环境和营养物质、代谢抑菌素等方式,加强肠道生物的屏障功能，促进了食品的安全性和人类健康。因此，乳酸菌在食品行业的开发应用已成为热点，该领域的发展对促进人类健康，提升人类健康生活水平具有重大意义。

1.2 乳酸菌分类

乳酸菌作为一类能够对宿主生理功能产生有益作用的活性微生物，数量巨多，除极少数外，绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前，乳酸菌分为许多种属，它们各有其不同的特性，从食品应用和保健作用来说，目前开发的菌株尚不多[6]。目前在食品中常用的主要分为3类，即双歧杆菌属、乳杆菌属和链球菌属。乳酸菌分类及其功能见表1。

1.3 乳酸菌的主要生理功能

益生菌进入人体肠道后，与肠内其他微生物产生了一系列复杂关系并最终达到促进宿主健康的目的。益生菌的主要生理功能如下。

1.3.1 生物屏障作用

益生菌产生的有机酸、细菌素和蛋白质可以改变细菌细胞膜的通透性，调节肠道pH值，抑制有害菌的生长繁殖；益生菌的表面分子与宿主上皮细胞分子识别受体相结合，从而调节肠道屏障功能[7]。

1.3.2 调节肠道菌群平衡

肠道内各种微生物相互作用，肠道内部分乳酸菌不受外界菌株影响，有一套自我平衡系统，而后迅速增殖形成优势菌，并抑制致病菌繁殖。嗜热链球菌能够抑制病原菌生长，防止坏菌滋生，治疗疾病，改善肠道微环境[8]；长双歧杆菌具有调节肠道功能紊乱，维护肠道微环境稳态作用[9]。

1.3.3 营养吸收

益生菌在动物体内还可产生多种消化酶如淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶等，它们促进了营养物质特别是下消化道营养物质的消化和吸收。乳酸菌不仅可以产生多种酶类，而且能通过产酸，提高钙、磷、铁的利用率，还能促进维生素D的吸收和利用[10]。

1.3.4 免疫调节

阻止外界环境中的病原菌入侵，能够有效地提高干扰素和巨噬细胞的活性，参与调解细胞吞噬功能中细胞因子的分泌及宿主和抗原之间的免疫反应，进而提高机体对致病菌的免疫力[11]。

1.3.5 抗衰老、抗癌作用

具有抗胆固醇功能，能明显减少肠管对胆固醇的吸收，同时促进胆固醇转变为胆酸盐，从而加快其排出体外，对延缓机体衰老有积极作用。嗜酸乳杆菌能够增加肠道内益生菌的数量及生命力，并且具有一定的抗癌作用；嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌共同培养，其抗癌活性显著增强，癌细胞的增殖显著降低[12]。

2 新型检测技术

目前，乳酸菌鉴定大多仍沿用传统方法，但是传统分析法存在一定缺陷：步骤繁琐，费时费工，并且对于选择性培养基的质量要求严格，灵敏度低。受操作者经验影响较大，难以满足市场精确鉴定和定量的要求。

2.1 免疫学技术

胡陆军[13]利用ELAA(酶联适配体测定)方法，针对短双歧杆菌，线性关系为y=0.0588x+0.3423(R2=0.984)，检测范围为103～107CFU/mL，检测限可以达到103CFU/mL。针对两歧双歧杆菌，线性关系为y=0.07663x+0.1471(R2=0.983)，检测范围为104～107CFU/mL，检测限为104CFU/mL。

袁耀武等[14]通过动物免疫方法制备了鼠抗长双歧(B.longum)和两歧双歧杆菌(B.bifidum)的免疫血清及兔抗长双歧和两歧双歧杆菌的免疫血清，经双夹心ELISA法对双歧杆菌发酵乳制品中双歧杆菌进行检测，检测最低浓度可达107CFU/mL，仅耗时8 h。

2.2 qPCR技术

发酵乳制品中副干酪乳杆菌先经PMA处理后，采用沸水浴的方法提取副干酪乳杆菌基因组，然后通过qPCR方法检测发酵乳制品中的活菌[15]。结果副干酪乳杆菌经90 ℃处理6 min，即为膜损伤菌；PMA能够抑制107CFU/mL死菌DNA的扩增，而不影响活菌DNA的扩增；PMA-qPCR能够准确检测到样品中的活菌。

2.3 基因组学分析法

李柏良等[16]基于Illumina Hiseq 2500与Pacbio RSII测序平台对嗜热链球菌KLDS SM进行全基因组测序并绘制基因组图谱，结果表明:菌株KLDS SM的基因组由一个1856787 bp环状染色体组成，GC含量为39.08%，含有1732个蛋白质编码基因；菌株KLDS SM具有完整的蛋白水解系统和8种氨基酸的合成能力；15株嗜热链球菌在氨基酸合成方面相对保守，仅在组氨酸合成途径方面存在较大的差异。

赵洁[17]采用Illumina Hiseq高通量测序平台完成了185株分离自国内外自然发酵乳中嗜热链球菌的全基因组重测序，引入全基因组关联分析完成了嗜热链球菌的功能基因组学研究，建立了嗜热链球菌的核心基因集和泛基因集，结果揭示了高突变率主要发生在嗜热链球菌基因组的假基因区和基因间区，并通过全基因组关联分析挖掘出与嗜热链球菌表型特征相关的功能基因。

2.4 实时荧光定量PCR

陈臣等[18]利用SMM系统筛选植物乳杆菌种特异序列，根据特异序列设计引物进行实时荧光定量PCR反应，检测限为2.26×102CFU/mL。该方法快速灵敏,可以在实际生产中应用。

肖其胜等[19]根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区域设计特异性引物和探针，建立了食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应PCR检测方法。DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg，相对灵敏度可达到104CFU/mL。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。

张娜娜等[20]根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计特异性引物与探针，灵敏度达到3 pg,相对灵敏度达到103CFU/mL；重复性检测表明标准偏差在2.6%以下。标记嗜酸乳杆菌的样品全部检测出嗜酸乳杆菌且含量在5.83×102～3.68×104CFU/mL。

包秋华等[21]根据乳酸菌的16S rDNA基因序列设计嗜酸乳杆菌种特异性引物，应用种特异性PCR和实时荧光定量PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱和实时荧光定量PCR图谱分析，建立快速、准确地检测发酵乳中的定量和定性方法。

2.5 磁珠捕获法

Mullane N R等[22]使用阳离子磁珠捕获法检测婴幼儿配方粉(infant formula milk，IFM)中的阪崎肠杆菌：均质1 min，BPW增菌6 h，阳离子捕获，然后培养，如此可在较短时间内可靠检测IMF中1～5 CFU/500 g的阪崎肠杆菌。

2.6 LAMP技术

胡连霞等[23]采用改良环介导等温扩增(LAMP)技术检测PIF中的阪崎肠杆菌。以阪崎肠杆菌新属菌种(ATCC29544)的16S～23S rDNA间区序列作为靶序列，设计内外引物和环引物，通过肉眼观察白色沉淀，判断检测结果。LAMP检测阪崎肠杆菌的灵敏度为0.10 CFU/mL，人工污染阪崎肠杆菌的IFM的检出限为1.1 CFU/g。

2.7 DHPLC技术

杨春华等[24]应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，根据阪崎肠杆菌16S～23S rDNA特异基因序列的特点设计特异性引物，PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。检测低限可达到25 CFU，且具有很好的特异性。

2.8 PCR-DGGE技术

王营等[25]应用PCR-DGGE技术，并结合种特异性PCR技术检测酸奶中的乳酸菌组成。优化DGGE检测相关条件，结果表明最佳DGGE条件为:凝胶变性梯度范围30%～60%，电泳时间300 min。利用上述条件能有效区分植物乳杆菌、乳双歧杆菌,但是无法区分保加利亚乳杆菌与嗜酸乳杆菌，嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌与干酪乳杆菌;在此结果基础上，再采用种特异性PCR技术，能够有效区分上述存在共迁移现象的菌株。

2.9 T-RFLP技术

张思璐等[26]采用源于16S～23S rRNA基因间隔区序列的乳酸杆菌属特异性引物LAB-rev，乳酸杆菌的属特异性引物，6-FAM荧光标记后结合16S上游通用引物7f用于乳酸杆菌的PCR扩增。选取HaeⅢ和HhaⅠ进行限制性酶切，最后对酶切后的产物末端测序得到T-RFLP峰谱图，成功搭建T-RFLP技术用于微生态环境中乳酸杆菌检测的平台。

2.10 MLST方法

刘文俊[27]应用传统实验室发酵方法对43株嗜热链球菌和39株保加利亚乳杆菌进行了酸奶发酵实验，同时应用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌与发酵、产酸和风味形成特性相关的功能基因多位点序列分型(MLST)方法，进行菌株系统发育和遗传进化研究。结果表明：43株嗜热链球菌的发酵时间在4.5～24.5 h，19株菌发酵时间小于10 h，其中10株菌的产酸速率在10° T/h以上。39株保加利亚乳杆菌的发酵时间在8.5～24.5 h，23株菌的发酵时间小于15 h，其中有14株菌的产酸速率在3° T/h以上。

2.11 流式细胞技术

程志才等[28]添加荧光标记QEPV的M17培养基培养嗜热链球菌，采用流式细胞术检测QEPV能否被嗜热链球菌吸收。流式细胞术检测结果表明，FAM-QEPV与FITC-QEPV能够穿过嗜热链球菌细胞膜，推测QEPV能够被嗜热链球菌吸收、利用。并且0.5 mg/mL的QEPV能有效促进嗜热链球菌的生长繁殖，提高嗜热链球菌的发酵能力。

2.12 色差分析法

王佳等[29]借助细菌总数快速检测仪对加入指示剂后的样品颜色(RGB)变化进行检测，建立了色差值b值与嗜热链球菌数目之间的标准方程，相关系数可达到0.9820。对标准曲线进行准确度分析，与国标计数法检测结果差异不显著。

3 总结

作为益生菌中重要的有益菌，在食品工业日益发达的今天，如何更好地将益生菌应用于食品工业中，使人们对益生菌中乳酸菌有更加清晰的认识，这是每一位科研工作者值得深思的问题。大量的研究已证实益生菌的重要性和功能性，然而它们最大的缺点是活菌期时间短。在今后的研究方向中，利用分子生物学技术和基因工程等手段进行基因改造，培育出功能强大、能长久定居肠道的益生菌，保持益生菌稳定，并使益生菌达到足够量从而充分发挥其益生作用是技术核心问题。提高乳酸菌菌体的生理功能稳定性，减少发酵产品品质的不稳定性，使益生菌长期保存也是热门研究方向。相信随着研究的深入，益生菌能够在未来给人类的健康和社会的发展带来更大益处，具有广阔的开发和应用前景。