p PB修饰的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的制备研究

木尼热·库尔班，王 梅，由淑萍，刘 涛（新疆医科大学公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

肉苁蓉（Herba Cistanches）为列当科植物管花肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾、益经血、润肠通便等作用，有“沙漠之参”之称[1-3]。苯乙醇总苷是肉苁蓉的主要化学成分之一，主要包含松果菊苷与毛蕊花糖苷两种成分。研究显示苯乙醇总苷能够明显抑制机体内酪氨酸酶的活性，并在修复自由基损伤、抗衰老、抗疲劳、抗色素沉着、抗老年痴呆症方面显示了强大的功效[3-5]。

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是肝脏遭受反复或慢性损伤后的一种损伤与修复过程，主要与慢性炎症和引起慢性肝脏损伤的化学因素相关。研究表明，肉苁蓉苯乙醇总苷可降低肝纤维化大鼠肝组织中的胶原纤维生成，因此具有良好的抗肝纤维化的作用[6-8]。环肽pPB能特异性识别血小板源生长因子受体，因此能靶向到肝纤维化细胞。脂质体（liposomes）是由磷脂构成的双分子层结构的微型囊泡，脂质体作为药物载体具有缓释、降低药物毒性、保护被包封的药物和靶向性等特点，以脂质体给药后，其可将药物自动转运到肝、脾、肺和骨髓等组织器官，对于治疗肝、脾部位疾病及提高药物的治疗指数具有很好的作用[9-11]。在上述基础上，本研究拟将肉苁蓉苯乙醇总苷制成pPB环肽修饰的脂质体，利用pPB环肽作用，使脂质体聚集到肝纤维化的细胞，更好地发挥肉苁蓉苯乙醇总苷治疗肝纤维化的作用。本研究采用不同的制备方法分别制备p PB修饰的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体，并选择松果菊苷为含量测定指标，对脂质体的粒径、电位和包封率进行测定，最终确定该脂质体的制备方法[12-13]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AB135-S分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；T6新世纪紫外可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限公司）；EYELAN-2100旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；Malvern Nano-2S90型激光粒径测定仪（英国马尔文仪器有限公司）；JEOL-1340H透射电子显微镜（捷欧路科贸有限公司）；85-2型控温磁力搅拌机（江苏金怡仪器科技有限公司）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

松果菊苷对照品（批号327A021，含量98%，北京索莱宝科技有限公司）；苯乙醇总苷原料药（实验室自制，纯度95%）；大豆卵磷脂（Lipoid公司）；二棕榈磷脂酰胆碱（DPPC，意大利Corden Pharma公司，批号T0343）；胆固醇（美国Sigma公司）；马来酰基-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（Mal-DSPE-PEG2000，美国Nanocs公司，批号130916）；p PB（Cys*-Ser-Arg-Asn-Leu-lle-Asp-Cys*，批号20170204，含量98.49%，上海吉尔生化有限公司）；N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯（SATA，美国Sigma公司，批号SLBR3300V）；Sephadex G-50（100-300）（美国Sigma公司，批号SLBB6637V）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法的建立

2.1.1 最大吸收波长的选择取适量甲醇溶解松果菊苷对照品，以甲醇作为空白，在紫外分光光度仪上200 ～ 400 nm范围内进行紫外扫描，考察最大吸收波长，结果显示在330 nm处松果菊苷有最大吸收。

2.1.2 标准曲线建立精密称取松果菊苷对照品适量，用甲醇溶解并定容至刻度，得200 µg·mL-1的松果菊苷对照品储备液。分别精密量取对照品储备液适量，用甲醇溶解，制得浓度分别为5.0、8.0、10.0、20.0、40.0 µg·mL-1对照品溶液，将各溶液置于330 nm处测定吸光度值，以浓度（C）对吸光度（A）值作线性回归，得线性回归方程C = 42.615 A + 1.210 8，r =0.999 8，结果表明，在5.0 ～ 40.0 µg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度实验配制10.0、20.0、40.0 µg·mL-1的低、中、高浓度的松果菊苷对照品溶液，每个浓度配3份，1天内重复测定3次，计算日内精密度，连续测定3 d，计算日间精密度。结果显示日内精密度和日间精密度的RSD值均小于2%，表明方法精密度良好。

2.1.4 回收率考察取0.8 mL肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体作为样品的加入量，并加入高、中、低浓度松果菊苷对照品溶液分别为0.5、1.0、2.0 mL，使对照品量分别为样品加入量的120%、100%、80%，样品与对照品溶液混合均匀后，用甲醇定容至刻度，用紫外分光光度计测定药物含量，计算对照品的加入量及回收率。回收率（%）=（测得总量-样品加入量）/实际对照品的加入量×100%。结果显示松果菊苷的平均回收率分别为98.85%、100.67%、99.62%，RSD均小于2%，回收率符合规定，结果见表1。

表1 苯乙醇总苷含量加样回收率实验结果Tab 1 Results of recovery rates of phenylethanoid glycosides

2.2 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的制备

2.2.1 薄膜分散法制备肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体称取卵磷脂、DPPC、胆固醇适量（质量比为2∶2∶1），溶于适量氯仿和甲醇混合溶剂中（氯仿∶甲醇 = 4∶2，v∶v），置于旋转蒸发仪，在49 ～ 50 ℃下旋转蒸发使成膜状，然后加入250 µg·mL-1的苯乙醇总苷水溶液旋转水化，即得脂质体，将所得脂质体分别用0.45 µm微孔滤膜挤压4 ～ 5次，0.22 µm的微孔滤膜挤压18 ～20次，即得肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体。

2.2.2 二次包封法制备肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体称取卵磷脂、DPPC、胆固醇适量（质量比为2∶2∶1），溶于适量氯仿和甲醇混合溶剂中（氯仿∶甲醇 = 4∶2，v∶v），置于旋转蒸发仪，在49 ～ 50 ℃下旋转蒸发使成膜状，然后加入250 µg·mL-1的苯乙醇总苷水溶液旋转水化，得脂质体备用。同法再次取磷脂成分溶于氯仿，旋转成膜状后，将制得备用的脂质体加入，再次旋转水化，即得二次包封的脂质体。将所得脂质体分别用0.45 µm的微孔滤膜挤压4 ～ 5次，0.22 µm的微孔滤膜挤压18 ～ 20次，即得肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体。

2.2.3 逆相蒸发法制备肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体称取质量比为2∶2∶1的卵磷脂、DPPC、胆固醇，溶于适量氯仿和甲醇混合溶剂中（氯仿∶甲醇 = 4∶2，v∶v），加入250 µg·mL-1苯乙醇总苷原料药水溶液适量，冰浴超声1 h，直至形成稳定的乳剂，采用旋转蒸发仪减压蒸发，达到胶态后，加适量水水化，继续减压蒸发除去残留溶剂，将所得脂质体分别用0.45 μm的微孔滤膜挤压4 ～ 5次，0.22 μm的微孔滤膜挤压18 ～20次，即得肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体。

2.2.4 pPB-DSPE-PEG2000的制备首先将环肽pPB分子中引入巯基（-SH），然后使p PB环肽上巯基与Mal-DSPE-PEG2000末端的马来酰基发生C-S加成反应。具体方法为：将4 mg pPB溶于PBS缓冲液，并与8 mg SATA混合，使SATA与pPB质量比为2 : 1,在室温下搅拌2 h后，加入Mal-DSPE-PEG2000，室温下磁力搅拌24 h，将所得反应产物用截留分子量为3500Da的透析袋透析除去多肽、SATA等，截留下链接好的产物p PB-DSPE-PEG2000，将产物冷冻干燥后备用。为检测偶联是否成功，将p PB-PEG2000-DSPE和Mal-PEG2000-DSPE分别溶于氚代氯仿中，分别测定1H-NMR，通过比较马来酰基特征峰（6.7 ppm）的消失与否来验证偶联是否成功。结果表明pPB-PEG2000-DSPE1H-NMR图谱中6.7 ppm未见相应的马来酰基峰出现，说明偶联已成功。

2.2.5 pPB修饰的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的制备称取大豆磷脂、DPPC、胆固醇、pPB-DSPE-PEG2000（质量比为10 : 10 : 5 : 1）溶于氯仿和甲醇的混合溶剂，同“2.2.2”项下方法制备pPB修饰的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体。

2.3 苯乙醇总苷脂质体的体外性质考察

2.3.1 不同方法制得的脂质体的粒径、电位测定采用Malvern粒径测定仪测定脂质体的粒径和电位，结果见表2，由结果可知，3种方法形成的脂质体粒径均在200 nm左右，粒径均匀，电位均在35 ～ 45 mV。

2.3.2 脂质体的包封率测定1）洗脱曲线测定：采用葡聚糖凝胶柱洗脱法测定脂质体的包封率，取SephadexG-50装柱，使径高比为1∶10（cm∶cm），取1 mL脂质体上样，用pH 7.2的磷酸盐缓冲液洗脱，流速控制在1 mL·min-1，每2 mL接取一个流份，共接取30个流份，所得流份分别用2 mL甲醇溶解，置于330 nm处测定吸收度，以流份为横坐标，以药物浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线。结果表明，脂质体流份在第3 ～ 6流份流出，游离药物在7 ～ 14流份流出。

表2 不同方法制得的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的粒径. n = 3Tab 2 Particle size of the phenylethanoid glycosides liposomes prepared by different methods. n = 3

2）不同制备方法制得的脂质体包封率的测定：包封率测定方法为：取SephadexG-50（粒径100 ～ 300 μm）装柱，使径高比为1 cm∶10 cm，取不同制备方法制得的脂质体1 mL分别上样，用pH 7.2的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速控制在1 mL·min-1，收集脂质体流份，从中取2 mL加甲醇破乳溶解后测定松果菊苷的含量，作为脂质体中包封的药物含量。另取苯乙醇总苷脂质体1 mL直接加甲醇破乳溶解后，测定松果菊苷的含量作为脂质体中药物总量。按下述公式计算包封率：包封率%=（脂质体中包封药物量/脂质体中药物总量）×100%。

本研究结果表明，采用薄膜分散法、二次包封法、逆相蒸发法制得脂质体的载药量分别为（28.55 ±5.61）%，（38.46 ± 7.85）%，（33.88 ± 3.50）%。用SPSS 16.0软件中SNK-Q检验对三种方法制备的肉苁蓉总苷脂质体包封率均数两两比较，以P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。结果显示，二次包封法制得的脂质体的包封率最高。

2.3.3 脂质体的载药量测定取制得的脂质体1 mL精确称重，记录载药脂质体的总重量，将此1 mL脂质体同“2.3.2”项下方法上样洗脱后，测得脂质体中的载药量，依据公式：载药量=Wd/WL×100%，其中Wd表示包封于脂质体中的药量，WL表示载药脂质体的总重量。

结果显示采用薄膜分散法、二次包封法、逆相蒸发法制得脂质体的载药量分别为（2.73±0.57）%，（3.71±0.32）%，（3.28±0.49）%。

2.3.4 pPB修饰的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的体外性质测定1）pPB修饰的苯乙醇总苷脂质体的粒径、电位、包封率、载药量的测定：对不同制备方法所得的脂质体的粒径、电位、包封率和载药量的结果进行比较，结果表明，二次包封法制得的脂质体的包封率和载药量最高，粒径和电位与其它制备方法相似，因此确定二次包封法是制备脂质体的最优方法。在此基础上，采用二次包封法制备了pPB修饰的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体，其粒径为（227.60±1.63）nm、电位为（- 45.37±1.62） mV、包封率为（35.55±7.35）%、载药量为（3.80±0.28）%。

2）脂质体形态观察：取二次包封法制得的p PB修饰的苯乙醇总苷脂质体混悬液1滴，滴至专用铜网上，用磷钨酸染色后，自然晾干，于透射电镜下观察脂质体形态，结果见图1。

图1 p PB修饰的苯乙醇总苷脂质体的透射电镜图Fig 1 TEM photo of pPB-modified phenylethanoid glycosides liposomes

3 讨论

脂质体是磷脂双分子层构成的囊泡，无毒副作用和免疫原性，用其包封药物后，具有使药物生物利用度提高，增加药物靶向性，降低药物毒性等优点。同时在脂质体表面偶联能与靶点高效结合的配体（如pPB环肽）后，可使脂质体与靶细胞表面相应的受体分子特异性结合，从而将药物靶向至具有特异性受体的细胞、组织或器官。

通过HPLC方法测定，发现肉苁蓉总苷主要成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷，这两种成分在HPLC条件下能够同时出峰，其中松果菊苷含量更高，同时根据文献报道，肉苁蓉总苷可选用松果菊苷作为指标性成分，因此本研究选用松果菊苷作为测定肉苁蓉总苷的指标性成分。有文献报道，除HPLC方法外，由于松果菊苷在总成分中占比较高，因此为了便于测定，本文在采用UV法测定肉苁蓉苯乙醇总苷含量时，以测定松果菊苷含量为主要指标[14]。

凝胶柱层析法是利用分子筛的原理，通过在凝胶柱上滞留时间的差别对传递体和游离药物进行分离，脂质体的分子大，滞留时间短，洗脱较快；游离药物分子小，滞留时间长，洗脱较慢，从而使脂质体与游离药物得到较好的分离。选择适当的有机溶剂和油水比可制备较稳定的脂质体，本研究过程中发现氯仿和甲醇混合溶剂为有机溶剂，比单独使用一种溶剂更容易形成稳定的脂质体。

本实验测得的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的包封率较低，可能与该药物本身的性质有直接的关系。当药物油水分布系数（logP）＜ - 0.3或＞ 4.5时，药物可被包封成具有较高包封率的脂质体，否则包封率较低。肉苁蓉苯乙醇总苷的logP约为1，介于两者之间，这可能是导致脂质体包封率较低的主要因素[15]。