HPLC法测定复方金钱草丸中槲皮素的含量

曹 红，水彩红，胡 丹，单婷婷，张贵英（中央军委后勤保障部卫生局药品仪器检验所，北京 100071）

复方金钱草丸是由金钱草、肉桂、延胡索、三七、五味子等14味中药组成的复方医院制剂。具有清热利湿，益肾固精，软坚散结功效。临床上主要用于治疗急、慢性前列腺炎，前列腺肥大。原质量标准中只有检查项，根据全军医疗机构制剂标准提高课题的要求，在原有质量标准基础上，增加了肉桂、金钱草、延胡索、五味子四味药材的薄层色谱鉴别，采用HPLC法对复方金钱草丸中的金钱草进行了定量测定，结果满意，全面提高了该制剂的质量标准，使制剂质量达到基本可控。

1 仪器与试药

SHIMADZU 20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Satorious电子分析天平（德国赛多利斯股份公司）；KQ3200E医用超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

复方金钱草丸由原解放军后勤学院门诊部提供（批号：2014316，2014317，2014318；规格：60 g/瓶）。槲皮素对照品（100081-201408供含量测定用）、延胡索对照药材（120928-201208）、金钱草对照药材（121187-200302）、五味子对照药材（120922-201309）、延胡索乙素对照品（110726-201414）、桂皮醛对照品（110710-201418）、五味子甲素对照品（110764-200408）均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇为色谱纯，水为重蒸水，所用其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

参考《中国药典》2015年版一部相关内容[1]，对处方中君药金钱草、臣药延胡索、肉桂和五味子开展了薄层色谱研究，分别按处方量制备了相应的阴性对照样品，结果表明上述鉴别药材阴性对照样品未见干扰，故均列入了提高后的质量标准中，即采用薄层色谱法鉴别了处方中金钱草以槲皮素和山柰素为对照；肉桂以桂皮醛为对照；延胡索以延胡索乙素为对照；五味子以五味子对照药材和五味子甲素为对照。

此外还对处方中三七、绵萆薢等药材开展了薄层色谱研究，因相应阴性对照有干扰或有效成分斑点不明显等原因未收入到该药品的质量标准中。

2.2 含量测定

采用高效液相色谱法对处方中君药金钱草中槲皮素开展了相关研究，经方法学验证，结果比较满意，故列入到该药品的质量标准中。

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（42∶58）为流动相；检测波长360 nm。理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于3000。

2.2.2 对照品溶液的制备取槲皮素对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.4 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2.5 色谱柱的选择试验中方法学研究采用了ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 µm）（Agilent）。此外，还分别比较了CAPCELL PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）、Agilent Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）、依利特 Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），结果显示采用以上不同商品类型的反相C18色谱柱均可将样品中槲皮素与其他组分进行有效分离。

2.2.6 前处理条件的选择[2-6]分别参照《中国药典》（2015年版）金钱草药材项下含量测定项供试品提取方法与本文“2.2.3”项下供试品提取方法，测定复方金钱草丸中槲皮素的含量。两种提取方法所测得的槲皮素含量无显著性差异，故选择了提取步骤较为简单的本文“2.2.3”项下的提取方法。

2.2.7 专属性实验阴性对照溶液的制备：按处方中药味的比例，配制不含金钱草药材的阴性样品，按其工艺制成空白制剂，再按“2.2.3”项下方法制备，即得。

按“2.2.1”项下色谱条件测得对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液的HPLC色谱分离图，结果表明阴性对照溶液的HPLC色谱图中，在与槲皮素峰相应的出峰时间处无干扰峰出现，详见图1。

图1 HPLC色谱图A - 槲皮素对照品溶液，B -复方金钱草丸供试品溶液，C - 阴性对照溶液；1 - 槲皮素Fig 1 HPLC chromatogramsA - quercetin reference solution, B - compound Jinqiancao pills for trial solution, C - negative control solution; 1 - quercetin

2.2.8 线性关系的考察分别精密吸取槲皮素对照品溶液（0.145 32 mg·mL-1）0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，配制成不同浓度的对照品溶液，分别精密吸取10 μL，依次注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”项下方法测定峰面积，以槲皮素峰面积积分值为纵坐标（Y），槲皮素进样量（μg）为横坐标（X），绘制标准曲线，回归方程为：Y =4.0×106X - 1.118 7×104，相关系数r = 1（n = 6）。结果表明槲皮素在0.029 1 ～ 0.726 6 mg范围内呈良好的线性关系。

2.2.9 样品溶液稳定性实验将待测样品溶液，按“2.2.3”项下方法进行制备，分别于0、1、3、6、9、12、22 h定期进样测定，结果表明7次测定槲皮素的RSD值为0.88%，样品溶液在22 h内基本稳定。

2.2.10 重复性实验取同一批次（批号为2014316）的复方金钱草丸样品6份，按“2.2.3”项下方法制备，并进行测定，结果表明复方金钱草丸中槲皮素的平均含量为0.371 mg·g-1，RSD = 1.02%（n = 6），显示出该方法重复性良好。

2.2.11 准确度实验（加样回收率实验）取已知含量的复方金钱草丸（批号为2014316，槲皮素含量为0.371 mg·g-1）样品1.0 g，共测定6份，分别精确加入槲皮素对照品，按“2.2.3”项下方法操作，测定其含量，并计算回收率，结果显示本方法具有良好的回收率，详见表1。

表1 样品中槲皮素的加样回收率实验结果Tab 1 The result of recovery test

2.2.12 样品测定选取复方金钱草丸3个批次，按上述方法进行含量测定，计算槲皮素含量，结果见表2。

表2 样品中槲皮素含量测定结果. n = 3Tab 2 The results of content determination in the sample. n = 3

根据《中国药典》（2015年版）金钱草项下槲皮素的含量限度，以及本品的制备工艺及测定结果，按70%的转移率来计算，暂定本品每1 g含金钱草以槲皮素（C15H10O7）计，不得少于0.30 mg。

3 讨论

3.1 流动相的选择[2-6]

曾选用甲醇-酸水，乙腈-酸水等溶剂系统，结果显示以上系统可以使槲皮素与其他色谱峰达到较好的基线分离，故选择甲醇-0.4%磷酸溶液（42∶58）为测定的流动相。

3.2 检测波长的选择

槲皮素对照品溶液（浓度为15 µg·mL-1）经紫外吸收光谱扫描，在258 nm和360 nm处有最大吸收，试验结果表明在360 nm处供试品溶液色谱中色谱峰干扰少，故确定检测波长为360 nm。

3.3 供试品溶液提取方法的选择[1]

采用甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）考察了加热回流提取1次和2次，每次1 h、超声提取1 h等方法，结果显示加热回流提取1次、时间1 h已较完全，因此本课题组采用了此较为简便的供试品溶液提取方法。