HPLC法测定扑麻滴鼻液中有效成分含量的方法学研究

任 韡，黄晓舞，刘 坤，苏欢欢，范金钊，白 林，李 欣（.解放军总医院制剂中心，北京 00853；.天津医科大学，天津 300070）

扑麻滴鼻液收载于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2015年版），主要成分为盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏，用于治疗过敏性鼻炎、鼻窦炎、鼻黏膜肿胀等[1]。盐酸麻黄碱被纳入易制毒化学品管理，长期或超剂量使用可导致鼻黏膜萎缩，并可产生药物依赖，对于心脏病和高血压的患者，可引起血压升高、心率加快等副作用。马来酸氯苯那敏为抗组胺药，可引起消化系统、泌尿系统、神经系统的不良反应[2]。现行标准中含量测定方法显示色谱基线不好，盐酸麻黄碱峰受溶剂峰干扰大，马来酸氯苯那敏峰矮且宽，测定结果准确性差，所以有必要进一步优化色谱条件，建立更加准确、有效的含量测定方法。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（包括1200系列在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、色谱工作站，美国Agilent公司）；UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；色谱柱：Dikma Platisil ODS柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；pH计（SevenEasy，德国Mettler公司）；MS250DU型电子天平（德国Mettler公司）。

扑麻滴鼻液（本院自制，批号：20170713、20170927、20171012）；马来酸氯苯那敏对照品（批号：100047-201507，纯度99.7%），盐酸麻黄碱对照品（批号：171241-201007，纯度99.7%），均来源于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯；磷酸二氢铵、三乙胺、磷酸、磷酸二氢钾、异丙醇等均为分析纯；水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma Platisil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：磷酸二氢铵缓冲液（称取磷酸二氢铵11.5 g加水溶解，加磷酸1 mL，加水稀释至1000 mL，摇匀即得）-乙腈（80∶20）；检测波长：257 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃[3]；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液精密称取盐酸麻黄碱对照品26.0 mg、马来酸氯苯那敏对照品7.7 mg，置于25 mL容量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀，制成对照品储备液。精密量取储备液4 mL置于10 mL容量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成对照品溶液（含盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏分别为414.75 μg·mL-1、122.83 μg·mL-1）。

2.2.2 供试品溶液精密量取供试品5 mL，置于50 mL容量瓶中，加流动相定容，摇匀。精密量取上述溶液4 mL置于10 mL容量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液另按处方比例及制备工艺，配制不含盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏的空白制剂，依供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，盐酸麻黄碱、马来酸氯苯那敏的保留时间分别为4.5、17.4 min，峰形对称尖锐，基线平稳，与其他色谱峰分离良好，阴性样品在相应位置上无干扰峰，详见图1。

2.4 线性关系的考察

分别精密量取“2.2.1”项下的对照品储备液2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶中，加流动相定容制成标示含量的50%、75%、100%、125%、150%的系列标准溶液。按“2.1”项下的色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），标准溶液浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程分别为：盐酸麻黄碱Y = 0.947 X -1.548，r = 0.999 9；马来酸氯苯那敏Y = 17.954 X - 4.103，r = 0.999 9。结果表明，盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏分别在207.38 ～ 622.13 μg·mL-1、61.42 ～ 184.25 μg·mL-1范围内，呈现良好的线性关系。

图1 HPLC色谱图A -对照品，B - 供试品，C -阴性对照；1 -盐酸麻黄碱，2 -马来酸氯苯那敏Fig 1 HPLC chromatogramsA - reference substance, B - sample, C - negative reference substance;1 - ephedrine hydrochloride, 2 - chlorphenamine maleate

2.5 精密度实验

取“2.2.1”项下的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次测定，计算盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏的峰面积RSD（n = 6）分别为0.20%、0.27%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

按“2.2.2”项下方法，制备6份供试品溶液。按“2.1”项下的色谱条件测定，以外标法测定，按标示含量百分数计算，盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏分别为102.1%、101.9%，RSD分别为0.09%（n = 6）、0.20%（n =6），表明方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进行测定，盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏峰面积RSD（n =6）分别为0.19%、0.41%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.8 回收率实验

按处方比例称取盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏对照品（相当于标示量的80%、100%、120%），并加入其它辅料配制成低、中、高浓度样品，按“2.2.2”项下方法制备各浓度供试品溶液各3份，按“2.1”项下的色谱条件测定，计算回收率，盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏平均回收率分别为100.8%、99.4%，RSD分别为0.91%、1.30%，详见表1。

表1 回收率实验结果. n = 9Tab 1 Results of recovery test. n = 9

2.9 耐用性实验

2.9.1 流动相pH按“2.1”项下方法配制流动相，用磷酸分别调节pH至2.70、3.20、3.50，进行测定，计算盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏的峰面积RSD（n = 3）分别为0.55%、0.06%，表明在pH 2.70 ～ 3.50范围内均能满足系统适应性要求。

2.9.2 流动相比例按“2.1”项下方法配制磷酸二氢铵缓冲溶液，依次将流动相比例（磷酸二氢铵缓冲溶液：乙腈）调节为78∶22、80∶20、82∶18，其余条件不变，进行测定，计算盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏的峰面积RSD（n = 3）分别为0.49%、0.12%，结果表明流动相比例略有变化时，仍能满足系统适应性要求。

2.9.3 柱温分别调节柱温为30、35、40 ℃，其余条件按“2.1”项下色谱条件测定，计算盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏的峰面积RSD （n = 3）分别为0.11%、0.19%，结果表明柱温在30 ～ 40 ℃范围内，均能满足系统适应性要求。

2.9.4 流速分别调节流速为0.8、1.0、1.2 mL·min-1，其余条件按“2.1”项下色谱条件测定，计算盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏的峰面积RSD（n = 3）分别为0.61%、0.40%，结果表明流速在0.8 ～ 1.2 mL·min-1范围内，均能满足系统适应性要求。

2.9.5 色谱柱分别换用Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Dikma Platisil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），其余条件按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果显示换用不同色谱柱，含量测定结果无明显差异，表明该方法耐用性良好。

2.10 样品含量测定

取3批样品，每批3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进行测定，以标示量百分数计算，结果见表2。

表2 扑麻滴鼻液含量测定结果Tab 2 Contents determination of ephedrine hydrochloride and chlorphenamine maleate in Puma nasal drops

3 讨论

HPLC法测定盐酸麻黄碱或马来酸氯苯那敏单一组分，在药典[4]中已有收载，关于采用HPLC法同时测定多种药物活性成分的报道很多[5-8]，为本实验提供了参考。但同时测定盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏两组分含量，在现有文献中报道较少。金丽等[9]建立了高效液相色谱法同时测定扑麻滴鼻液中盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏的含量，操作繁琐，基线稳定性差，盐酸麻黄碱色谱峰受溶剂峰干扰明显，分离度较差，色谱条件需要进一步改善。

3.1 流动相的选择

为提高盐酸麻黄碱峰的分离度，减少溶剂峰的干扰，本实验曾尝试改变原方法的流动相比例，延长麻黄碱的出峰时间，但马来酸氯苯那敏保留时间受流动相比例影响较大，出峰时间过长。尝试采用梯度洗脱方法，可以改善分离度和出峰时间，但是基线漂移现象严重，且马来酸氯苯那敏峰形较小。反相高效液相色谱常用流动相为磷酸盐的缓冲溶液和弱极性有机溶剂（如乙腈、甲醇等）的混合溶液，尝试以乙腈-磷酸二氢铵缓冲溶液[6]、甲醇-磷酸二氢铵缓冲液[10-11]为流动相，结果发现后者不仅配制简单，且可避免使用三乙胺等刺激性有毒试剂，盐酸麻黄碱峰不受溶剂峰干扰，分离度得到较大改善，基线平稳。

3.2 检测波长的确定

原方法中采用盐酸麻黄碱的最大吸收210 nm作为检测波长，马来酸氯苯那敏峰小而宽，盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏峰高差异显著。通过紫外扫描吸收曲线可得，马来酸氯苯那敏和盐酸麻黄碱最大吸收波长分别为262 nm、257nm[9]。尝试采用210 nm、254 nm、257 nm、262 nm为检测波长，结果显示，采用257 nm为检测波长时，两主峰峰高差异明显降低，马来酸氯苯那敏峰形、基线均得到改善。

3.3 进样浓度的确定

采用原方法中的进样浓度，盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏峰高和峰面积均较小，影响含量测定结果的准确度。本实验将进样浓度提高4倍（盐酸麻黄碱含量约为400 μg·mL-1，马来酸氯苯那敏含量约为120 μg·mL-1），色谱分析结果显示，改善后盐酸麻黄碱和马来酸氯苯那敏峰高和峰面积呈相应比例增加，同时满足两组分定量测定要求。