抗隐孢子虫药物的研究进展

李俊强，晁利芹，张龙现

隐孢子虫(Cryptosporidium)在分类上属于原生动物界、顶复门、真球虫目、隐孢子虫科、隐孢子虫属，是一种重要的水源性和食源性传播的机会致病性人兽共患寄生原虫[1]。Tyzzer于1907年在小鼠的组织切片中首次发现并命名了隐孢子虫，迄今已经鉴定36个有效种，以及60多个基因型[2]。其中，90%以上的人体隐孢子虫感染都是由人隐孢子虫(C.hominis)和微小隐孢子虫(C.parvum)引起；感染人体的常见种类还包括：火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)，猫隐孢子虫(C.felis)，犬隐孢子虫(C.canis)，泛在隐孢子虫(C.ubiquitum)，兔隐孢子虫(C.cuniculus)，旅者隐孢子虫(C.viatorum)，鼠隐孢子虫(C.muris)，隐孢子虫花栗鼠基因型I(chipmunk genotype I)；以及一些偶尔感染人体的种类：安氏隐孢子虫(C.andersoni)，猪隐孢子虫(C.suis)，牛隐孢子虫(C.bovis)，肖氏隐孢子虫(C.xiaoi)，刺猬隐孢子虫(C.erinacei)，费氏隐孢子虫(C.fayeri)，母猪隐孢子虫(C.scrofarum)，泰泽隐孢子虫(C.tyzzeri)，隐孢子虫臭鼬基因型(skunk genotype)，水貂基因型(mink genotype)，马基因型(horse genotype)，等[3-4]。

隐孢子虫病每年导致近840万伤残调整寿命年(DALYs)，对于免疫正常人群的隐孢子虫病患者临床症状主要以自限性腹泻为主。然而，对于免疫力低下或功能缺陷的隐孢子虫感染者，则可引起严重的胃肠炎症状并伴随水样腹泻，导致体液大量丢失甚至危及生命[1-2]。隐孢子虫是发展中国家第2大最为重要的儿童致腹泻病原体[5]，有研究表明即使治愈之后亦可导致婴幼儿发育迟缓。隐孢子虫病已经被世界卫生组织(WHO)列为人类最常见的6种腹泻病之一。世界范围内隐孢子虫感染常引起大规模的暴发和流行，特别是在发达国家或地区[4,6]。微小隐孢子虫可感染人类和多种哺乳动物，是食源性和水源性传播的主要种类[4]。同时在一些自然水源中亦可检测到隐孢子虫卵囊，由于其可能作为生化武器的潜在性，美国疾病预防控制中心(CDC)将其列为B类病原。近年来，先后有超过200种化合物被研究用于隐孢子虫病的治疗，然而到目前仍没有筛选到适合的药物。本文将近些年来国内外有关抗隐孢子虫药物，及新开发化合物的种类及作用方式的研究进展进行综述，以期对临床治疗隐孢子虫病提供帮助。

1 目前临床治疗在用药物

1.1硝唑尼特 硝唑尼特(nitazoxanide)是一种高效广谱的抗肠道寄生虫药物[7]。2002年，经美国FDA批准用于治疗隐孢子虫病的特异性药物，到目前也是唯一一种被批准药物。硝唑尼特药物的作用机制尚不十分明确，有研究表明硝唑尼特口服后的主要活性物质和代谢产物替唑尼特(tizoxanide)进一步与葡萄糖醛酸结合生成葡萄糖醛酸替唑尼特，能有效抑制隐孢子虫子孢子和卵囊的生长。硝唑尼特的临床药效试验数据来源于HIV呈阴性的隐孢子虫病参与者的随机试验，显示显著高的治愈率达到93%(使用安慰剂对照组为30%～40%)[8]。然而，在随后的临床治疗过程中发现硝唑尼特对于HIV呈阳性的儿童和成年人合并隐孢子虫感染者无显著作用[9-10]。因此，硝唑尼特主要用于治疗免疫正常的成年人群和>1岁的儿童患者[11]。然而，近年来有报道显示具有腹泻症状的肾移植人群合并隐孢子虫感染者，硝唑尼特和氟喹诺酮(fluoroquinolone)联合使用具有良好的卵囊清除率[12]。

1.2抗生素类药物 一些抗生素类药物虽然没有被批准用于治疗隐孢子虫病，但临床上亦有作为替代选择药物的报道[13]。其中，巴龙霉素(paromomycin)是一种广谱的氨基糖苷类抗生素，主要作用于核糖体氨酰tRNA。在隐孢子虫致腹泻病的治疗上，巴龙霉素是第一个临床受试药物。在细胞试验中巴龙霉素表现的抗隐孢子虫作用较弱，小范围的临床试验表明巴龙霉素有中等活性的抗隐孢子虫作用，并且对艾滋病人合并隐孢子虫感染者部分有效[14]。在治疗具有慢性腹泻症状的儿童隐孢子虫感染者时，巴龙霉素在临床症状的改善方面较硝唑尼特疗效要高[15]。而在2000年进行的一项双盲对照试验显示巴龙霉素和安慰剂对照组相比并没有明显治疗优势。

阿奇霉素(azithromycin)是大环内酯类抗生素，相比其它抗蠕虫药物显示有效的抗隐孢子虫作用[16]。联合用药比单一药物具有更好的疗效，研究表明在艾滋病人合并隐孢子虫腹泻患者的治疗试验中，阿奇霉素联合巴龙霉素治疗能够显著减少卵囊的排泄及改善临床症状[17]。同样，在实质器官移植合并隐孢子虫感染的人群中，阿奇霉素和硝唑尼特联合使用时抗寄生虫感染的效果明显增强[18]。

螺旋霉素(spiramycin)是另一种较早用于隐孢子虫病治疗的抗生素。螺旋霉素对于免疫正常儿童由隐孢子虫所致的急性腹泻有一定的效果，它能缩短腹泻时间及粪排隐孢子虫卵囊时间，该药也对艾滋病和骨髓移植病人合并隐孢子虫感染者有一定疗效[19]。也有报道显示，螺旋霉素能够减少小鼠模型中隐孢子虫卵囊的排出量[20]。

此外，还有其它一些抗生素类药物，如拉沙里菌素和西尼霉素也能预防及清除大鼠肠道内隐孢子虫感染。上述抗生素类治疗药物均呈剂量依赖性，也就是说必须使用大剂量方能有预防或治疗作用，但均只能减少不能清除肠道内隐孢子虫，停药后容易复发，且尚有治疗隐孢子虫病无效的报道，因此这些药物的临床治疗效果还需进一步研究[13,19]。

1.3中药成分类药物 大蒜素(garlicin)是从大蒜中提取的蒜辣素制成，蒜辣素产生的二烯丙基二硫化物、二烯丙基化三硫化物及蒜硫苷等有效活性成分均有较强的杀菌作用。早在1994年就有大蒜素治疗172例婴幼儿隐孢子虫感染性腹泻临床病例的报告[21]，随后1997年和2010年分别报道采用大蒜素治疗合计超过300例婴幼儿隐孢子虫致腹泻的病例，且治疗过程中没有发现明显的不良反应[22-23]。2015年，Huang等[24]报道在接受康复治疗的吸毒者中测试了乙酰螺旋霉素联合或不联合大蒜素的抗隐孢子虫效果，发现联合治疗的治愈率(92.1%)较单独用药治疗(72%～76%)和安慰剂组(61.8%)高。这些临床研究结果显示大蒜素是有效的抗隐孢子虫病的药物，然而大蒜素抗隐孢子虫作用机制尚不清楚。2009年张珍等[25]研究大蒜素对隐孢子虫感染小鼠模型的治疗效果发现治疗组小鼠粪便卵囊排出量明显减少，且大蒜素可以提高免疫抑制小鼠CD4+T细胞水平，促进肠道黏膜slgA的分泌[20]。

常山酮(halofuginone)是中药有效成分常山碱(febrifugine)的衍生物，主要用于家畜家禽球虫病及疟疾的治疗和预防。2007年Linder等[26]通过对常山酮差向异构化拆分得到一对对映体，并且对其进行了细胞抗隐孢子虫活性试验和小鼠体内的急性毒性试验，结果发现外消旋化的常山酮都有很强的抗隐孢子虫活性。同样，天然提取物姜黄素(curcumin)主要的生物学活性包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗多种原虫等，在体外(HCT-8细胞)以及免疫正常和抑制BALB/c小鼠体内均具有清除隐孢子虫感染的能力[27]。

在治疗隐孢子虫病的临床实践研究过程中，苦参合剂、补骨脂、双氢青蒿素、当归补血汤及其多糖等中药成分合剂，均有有效治疗隐孢子虫病的报道[19]。然而，作者认为这些中草药物主要通过对宿主细胞的免疫激发提高宿主自身免疫力，缓解隐孢子虫感染所致的腹泻症状，从而达到缓解隐孢子虫病症状的效果。

2 老药新用类药物

2.1他汀类药物 由于临床上治疗隐孢子虫病的迫切需要，抗隐孢子虫药物筛选的努力尝试从来没有停止过。目前，他汀类药物(statins)被广泛用于心血管疾病的治疗，其可抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶，该还原酶能将HMG-CoA转化为甲羟戊酸(mevalonic acid，MVA)从而阻碍胆固醇的生物合成[28]，甲羟戊酸还参与了蛋白的异戊二烯化修饰。隐孢子虫具有利用异戊二烯(isoprenoids)的多种代谢途径，然而缺乏所有已知用来合成异戊二烯前体的酶类。2013年，Bessoff等[29]在细胞模型中筛选鉴定出伊伐他汀(itavastatin)是隐孢子虫(C.parvum)卵囊生长的有效抑制剂。随后，Madbouly等[30]研究显示降胆固醇药物阿托伐他汀(atorvastatin)单独或联合硝唑尼特使用均可以有效治疗免疫抑制小鼠模型中隐孢子虫(C.parvum)感染，表现为肠内容物和粪便中的卵囊数量降低，与未经治疗的感染组相比联合治疗的小肠组织病理学变化有显著改善。鉴于阿托伐他汀众所周知的安全性和治疗高胆固醇血症和心血管疾病的常用方法，联合硝唑尼特可能被证明是治疗隐孢子虫病的一种有效的替代疗法。

2.2氯苯吩嗪 Love等[31]在体外细胞模型中基于细胞表型对78 942种化合物进行了抗隐孢子虫疗效的筛选，鉴定了12个具有活性且无细胞毒性的抗隐孢子虫化合物，包括氯苯吩嗪(clofazimine)是一种FDA先前批准用于治疗麻疯病(leprosy)的药物，并且具有良好的安全性。在体外细胞模型抗隐孢子虫(C.parvum和C.hominis)试验中显示有很强的活性，同样在小鼠体内感染模型中，连续3次氯苯吩嗪治疗后卵囊脱落量已经低于流式细胞仪检测限度，显示具有显著的抗隐孢子虫作用[31]。此外，Zhang等[32]成功开发了氯苯吩嗪纳米粒制剂以改善难溶性问题，并有可能提高其疗效。目前，氯苯吩嗪作为抗隐孢子虫药物已经用于临床人体试验[33]。

2.3茚地那韦 有研究显示茚地那韦(indinavir)作为HIV蛋白酶抑制剂以浓度依赖的方式抑制隐孢子虫(C.parvum)的细胞入侵，同时加载改良型性纳米粒试验显示出显著的抑制隐孢子虫(C.parvum)感染入侵，降低了茚地那韦的毒副作用[34]。纳米颗粒能够将药物输送到宿主肠上皮细胞和纳虫空泡内的微小颗粒，可以用来减少临床可用药物的剂量和毒副作用。这些被批准用于其它疾病的治疗的药物化合物，通过对抗隐孢子感染效果的研究显示具有良好治疗效果的药物，还有非吸收性的抗蠕虫药物恩波吡维铵恩波维铵(pyrvinium pamoate)，同样具有可作为治疗隐孢子虫病的潜在候选药物的报道[35]。

3 潜在疗效的先导化合物

3.1激酶抑制剂 随着隐孢子虫基因组测序、遗传操作、分子靶标鉴定等研究的深入，针对这些靶标物质的鉴定与优化方面已取得了重大进展。与其它真核细胞一样，原虫细胞也依赖由蛋白激酶控制的基本途径，精确地抑制这些蛋白激酶而不影响哺乳动物激酶是药物开发的目标。顶复门原虫的钙依赖性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases，CDPK)在宿主细胞入侵过程中起至关重要作用[36]，由于其与哺乳动物同系物相比缺少阻止进入活性部位的氨基酸，激酶抑制剂(bumped kinase inhibitors，BKI)被开发用来抑制隐孢子虫的CDPK1，并已筛选出一系列抑制剂化合物。Castellanos-Gonzalez等[37]研究了BKI-1517和BKI-1553在HCT-8细胞和小鼠模型中抗隐孢子虫的活性，发现83%的小鼠在服用治疗剂量后痊愈。同样，在隐孢子虫感染犊牛模型体内其抑制寄生虫的脱落和改善腹泻症状的功效也得到了验证[38]。随后，观察到BKI-1294、1369、1534和1649能够显著减少细胞(HCT-8)模型和IFN-γ基因敲除小鼠模型中隐孢子虫卵囊的感染量[39]，并且在犊牛模型中化合物BKI-1294能显著减少隐孢子虫卵囊的脱落量[40]。Huang等[41]评价了一系列低纳摩尔，以5-氨基吡唑-4-甲酰胺(5-aminopyrazole-4-carboxamide)为支架的CpCDPK1抑制剂，发现在体外细胞模型中能有效地抑制隐孢子虫(C.parvum)的生长，并显著降低新生小鼠的荷虫量。然而，Kuhlenschmidt等[42]研究显示吡唑并嘧啶衍生物(pyrazolopyrimidine derivatives)对CDPK1体外细胞模型中隐孢子虫的抑制作用与酶抑制没有很好的相关性。

其它潜在的激酶需要进一步的检测，以确定其作为治疗隐孢子虫感染靶点的生物学作用和潜力。例如，假定激酶家族(putative kinases，FIKKs)是一种寄生虫特异性蛋白激酶，已鉴定出有效的抑制剂，但抑制作用与寄生虫生长的影响无关[43]。以隐孢子虫脂激酶PI(4)K为靶点，通过筛选对隐孢子虫抑制作用的化合物，鉴定出靶向参与隐孢子虫蛋白质合成的酶也是一种有效的开发抗隐孢子虫药物的新策略。Manjunatha等[44]在体外细胞模型中筛选了6 220种抑制隐孢子虫(C.parvum)感染的化合物，并鉴定出吡唑并吡啶类化合物(pyrazolopyridines)具有抑制60%以上抗感染能力。对隐孢子虫脂激酶PI(4)K酶活性靶点的进一步优化筛选出了化合物KDU731，能显著减少IFN-γ基因敲除小鼠模型卵囊的脱落，以及犊牛体内卵囊脱落和改善腹泻症状。同时药物对动物机体的心脏毒性、致突变性、染色体畸形或光毒性试验显示没有内在风险[44]。因此，KDU731被鉴定为体内外抗微小隐孢子虫的最佳先导化合物，然而其临床性能有待进一步的研究。

3.2合成酶抑制剂 隐孢子虫脂肪酰辅酶A结合蛋白(fatty acyl-CoA binding protein，ACBP)可作为抗隐孢子虫感染药物筛选的靶点，通过体外细胞模型初步筛选一些抗隐孢子虫药物，有效化合物为溴代喹啉(broxyquinoline)、氯代喹啉(cloxyquin)、氯唑西林钠(cloxacillin sodium)和脱氢胆酸钠(sodium dehydrocholate)[45]。脂肪酰辅酶A合成酶(fatty acyl-coenzyme A synthetases，ACS)在脂肪酸代谢中是必需的，存在于各种顶复门原虫中，研究发现在体内外模型中使用Triacsin C靶向ACS作用于隐孢子虫，均具有高效的抗隐孢子虫作用[46]。油酰胆碱Oleylphosphocholine(OlPC)在诱导寄生虫细胞凋亡的同时，与抗寄生虫药物米替福新(miltefosine)的作用类似，它干扰了寄生虫脂质的合成和细胞膜的完整性。在一项非洲赞比亚患有隐孢子虫病的成年患者中，米替福新治疗表现出不良疗效和严重不良后果。另一方面，OlPC已经开发用于治疗利什曼病，并且在小鼠模型中显示出良好的耐受性。Sonzogni-Desautels等[47]在体内和体外对该化合物进行了抗隐孢子虫试验，发现OlPC抑制了HCT-8细胞模型中隐孢子虫(C.parvum)的感染，能够治疗小鼠模型中隐孢子虫(C.parvum)的致死性感染，并且30 d内没有复发的迹象。OlPC对HCT-8细胞的毒性作用明显优于米替福新，可作为抗微小隐孢子虫感染一个有效的潜在候选药物[47]。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族K11777(N-methyl piperazine-Phe-homoPhe-vinylsulfone phenyl)以浓度依赖的方式抑制细胞模型中隐孢子虫(C.parvum)的生长。此外，在免疫缺陷小鼠模型中口服或腹腔注射治疗10 d，也显示对微小隐孢子虫敏感[48]。tRNA合成酶将特定的tRNA与选定的氨基酸结合以合成蛋白质，在生物体生物过程中至关重要。化合物Benzoxaborole对真菌和细菌氨基酰tRNA合成酶具有已知的抑制活性，Palencia等[49]测试了一些抗隐孢子虫化合物的作用，一种3-氨甲基修饰的benzoxaborole化合物AN6426，被鉴定具有抗隐孢子虫亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)的活性，通过抑制活性位点的蛋白质合成来抑制其在细胞模型中的生长[49]。同样，Jain等[50]也测试了一系列喹唑啉酮(quinazolinone)为支架通过抑制脯氨酰tRNA合成酶(prolyl-tRNA synthetases)的化合物，验证了这些分子作为潜在的抗隐孢子虫候选药物[50]。Kumar等[51]评价了人隐孢子虫(C.hominis)具有双官能团的胸苷酸合成酶二氢叶酸还原酶(thymidylate synthase-dihydrofolate reductase)的一种抑制剂，显示显著减少了细胞模型中的寄生虫感染的作用。Mukerjee等[52]使用针对与纳米粒结合的寄生蛋白CP2的特异性抗体将抑制剂传递到吶虫空泡中，与单独使用抑制剂或纳米粒相比，细胞模型中隐孢子虫感染显著减少。这些研究表明药物输送到肠细胞的重要性，并可能有助于改善先前确定的疗法。

3.3其它抑制剂 最近，Jumani等[53]分析了开放式抗疟药箱(open access malaria box)，并确定MMV665917是一种有效的抗隐孢子虫抑制剂。MMV665917在急性小鼠模型中有效，在慢性小鼠模型中可逐步消除寄生虫感染，显示对于体内外清除隐孢子虫的感染是强效的抑制作用[54]。同样，Eltahan等[55]使用高通量筛选中发现了一种有机硒药依布硒林(ebselen)，它是隐孢子虫(C.parvum)葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)的选择性抑制剂，虽然CpGPI没有完全被抑制，但观察到体外寄生虫生长的抑制。

隐孢子虫的另一个重要代谢途径是嘌呤的合成，腺苷转化为鸟嘌呤核苷酸需要氧化还原酶肌苷5′-磷酸脱氢酶(inosine 5′-monophosphate Dehydrogenase，IMPDH)。这种酶似乎起源于细菌，因此其结构不同于宿主的直系同源物。CpIMPDH抑制剂对隐孢子虫具有体外药效[56]。Gorla等[57]在IL-12敲除小鼠模型中检测了8种CpIMPDH抑制剂的药效，其中，P131每日给药3次，体内抗隐孢子虫(C.parvum)效果优于巴龙霉素。靶向糖代谢途径中的关键酶乳酸脱氢酶LDH，通过计算生物学模拟显示小分子化合物CHEMBL1784973对微小隐孢子虫具有较强的抑制作用和药效特性[58]，这种方法对新药物的筛选起到了重要的推动作用。

4 结 语

隐孢子虫是一种在世界范围内广泛分布的病原体，可造成免疫抑制个体的持续性腹泻及儿童的发育迟缓。硝唑尼特是唯一被FDA批准用于治疗隐孢子虫病的药物，但对艾滋病人合并隐孢子虫感染者无效。由于临床上对治疗隐孢子虫病的迫切需要，抗隐孢子虫药物的筛选和研制越来越引起重视。由于隐孢子虫生物代谢途径的多样性(某些生物生物代谢途径可能完全消失或者高度简化)及自身药物外排作用的存在，使得隐孢子虫体内不能达到有效的药物浓度导致大多数受试药物效果不佳，给药物的研制和开发带来较大的困难。虽然目前已报道了一些候选药物，但还未筛选出治疗隐孢子虫病的特效药。而且多数抗隐孢子虫药物仍处于动物试验阶段，用于临床治疗的报道较少且结论尚不一致。随着新治疗靶点的发现与鉴定，为进一步设计和筛选选择性高，抑制性强的抗隐孢子虫药物奠定了基础。另一方面，新化合物或现有化合物的改进，以及现有批准药物的抗隐孢子虫活性的鉴定也是在将来研究的方向之一。

利益冲突：无