中国狂犬病口服疫苗的研究进展及其应用的紧迫性

俞永新，石磊泰

当前狂犬病仍然是一种严重危害人类的疾病，每年全球约60 000人患病死亡，大约每10 min就有1人死亡。大多数的病例发生在非洲(36.4%)和亚洲(59.6%)，99%以上的病例由犬咬伤引起，其中小于15岁儿童占40%。然而人和犬狂犬病在大多数发达国家和部分发展中国家全球约50个国家都已消除，其措施主要是对犬进行大面积疫苗免疫和严格的预防手段。随后采用减毒活疫苗对野生动物进行诱饵口服免疫，切断野生动物狂犬病传播给犬而再度发生人间狂犬病的危险性，最后达到持久性消除狂犬病。如欧洲和北美的许多国家已持续多年无狂犬病发生，但是在发展中国家人口多，犬的数量大，特别是那些难于接近的无主犬、流浪犬，采用注射方法对犬进行大面积免疫(一般要求应达到70%以上)十分困难，而且灭活疫苗的持久性短，需每年加强免疫，同时还有可能发生犬对注射人员咬伤的危险性。因此在口服疫苗对野生动物免疫成功的基础上，WHO和狂犬病专家提出并建议采用诱饵减毒活疫苗对犬进行口服免疫，用以提高犬的免疫覆盖率，达到消除和控制狂犬病的目标[1]。

动物口服疫苗的大面积现场应用最早于1978年在瑞士应用减毒活疫苗实施并证明其可行性。以后逐步扩大到欧洲其他国家和北美等国家，取得了降低野生动物狂犬病的明显效果，同时也极大地减少被动物致伤发生的家畜狂犬病和暴露后免疫人数，最终消除了这些国家的人间传染病。早期应用于疫苗的减毒株主要有重组痘病毒V-RG株和一些不同减毒水平的减毒株如ERA株、SADBern株、SADB19株和SAD5/88株，虽然这些毒株毒力显著减弱，但仍然对小鼠和其他野生动物保留残余毒力，存在传播感染的危害性[2-4]。以后通过科学家的努力，已经筛选到多株毒力更低，如对小鼠脑内、口服，肌内接种和其他动物无致病性的减毒株，其中二株毒种SAG2和V-RG已经WHO认可，推荐用于野生动物和犬的口服免疫。SAG2株不但对小鼠脑内接种无致病性，在乳鼠脑内连续传5代或细胞传10代后，对小鼠仍无脑内毒力，减毒基因未发生变化，表明其弱毒无返祖，遗传稳定性高，对犬和多种野生动物不致病[5-6]。SAG2株疫苗自1993年应用至今已有20多年的经验，在欧洲发放过2千万剂诱饵疫苗，未发现疫苗病毒引起其他动物和人感染狂犬病的不安全问题，在爱沙尼亚、法国、意大利、瑞士、芬兰等国家大规模应用后仅几年就使这些国家消除了狂犬病[7]。V-RG株除在少数欧洲国家应用外主要用于北美国家并使加拿大、美国消除了狂犬病。

WHO认识到犬口服免疫对消除狂犬病的重要意义，自1988年以来曾多次发表立场文件支持关于犬口服免疫(OVD)的研究和应用。曾召开过多次WHO专家委员会，讨论并制定有关犬用口服疫苗的研究、质量控制标准和最低要求以及现场应用指南[8-16]。

中国科学家在国外动物口服免疫成功的启发下，早在上个世纪80年代就开始着手研究动物口服免疫用毒种并进行犬口服免疫和安全性、有效性现场观察，有些减毒株虽未进行犬的现场免疫观察，但毒株的弱毒特征、免疫原性和遗传稳定性已接近和相当于国外现用的口服疫苗毒种，是很有应用前景的动物口服疫苗的候选株，现对这些毒株的研究进展过程综述如下。

1 CTN-1毒株[17-18]

CTN-1毒种来源于1955年分离自山东省济南市的狂犬病病人脑组织的狂犬病街毒CTN-S1，CTN-S1株在小白鼠脑内连续传49代后对小鼠的脑内致病力下降，发病潜伏期由11～14 d缩短并固定在3～6 d，同时皮下毒力显著降低，由4.0 lgLD50下降至1.5 lgLD50，表现为狂犬病固定毒，命名为CTN-M株。CTN-M株又经KMB17株人二倍体细胞连续传47代而适应于该细胞培养，命名为CTN-1株。CTN-1株的毒力进一步降低，对家兔脑内平均病期由1 d延长至4～5 d，但对小鼠的脑内毒力仍高于5.0 lgLD50。CTN-1病毒具有良好的免疫性，肌内免疫8只犬，1个月后的中和抗体100%阳转，均值>1∶320。

1.1CTN-1鼠脑疫苗(CTN-M22)[19]将CTN-1毒种在小白鼠脑传2代，命名为CTN-M22毒种，以CTN-M22毒种接种鼠脑，取鼠脑研磨成脑悬液加适宜的稳定剂制成疫苗。

1.1.1CTN-M22疫苗的安全性[19-20]在实验室对犬及其他动物进行安全性研究，以现场用量的10倍量口服接种3个月龄健康幼犬10只，免疫后1、2、3 d连续3次取唾液分离病毒均为阴性。观察6个月，动物未见狂犬病任何征象，均健康存活。对初生1月龄以内乳犬口服免疫7只，观察6个月亦安全存活。此外，还以肌内注射和隐神经浸润注射成年犬各10只，接种后于不同时间剖杀1只，共5次，取局部淋巴结、脑、肾和唾液腺标本，用乳鼠脑内接种法分离病毒，结果均为阴性，其余动物观察3个月，无任何狂犬病症状，另外口服接种黄毛鼠和猫各5只，肌肉注射黄毛鼠5只，观察21 d均健存[20]。

在应用现场对吉林省农安县和伊通县229只家犬和广西玉林县19 196只犬进行口服免疫观察，结果均未发现家犬出现任何症状，这些犬一直在犬主家放养，服苗犬与其他犬、猪等日常活动接触频繁，结果未发现这些动物的狂犬病发生，另对现场的怀孕母犬3只，产仔前服苗，共产仔犬15只，观察6个月，未发现母犬发病和对仔犬的垂直传播感染。

以上结果表明CTN-M22疫苗虽然对小白鼠有致病性，但对家犬十分安全，而且无对外传播病毒感染其他动物的危害性。

1.1.2CTN-M22疫苗对犬的免疫性 以5.65和7.00 lgLD50的病毒量，按每只犬4 mL量分别口服10只家犬，1个月后的抗体阳转率分别为81%和80%～89%，6月时分别为33.3%和83%～86%，疫苗有良好的免疫性，但病毒滴度高者抗体阳转率更高，免疫持久性更长。

1.1.3CTN-M22疫苗对家犬的保护效果 1985年和1986年在广西玉林市的20个乡中，对其中13个乡进行犬群口服免疫，免疫率分别为87.9%(4 456/5 069只犬)和87.3%(14 740/16 882只犬)，余下约12%未免疫犬作为内对照，结果第一年内免疫乡无犬狂犬病发生，内对照和相邻的外对照分别发生狂犬病11只和9只，第二年内对照和外对照乡分别出现狂犬15只和22只。

1.1.4家犬免疫后对降低人狂犬病的效果 1984年前全玉林市20个乡共发生人狂犬病27例，犬免疫后1985-1987年，玉林市共发病22例，其中在免疫前被咬伤者10例，未免疫内对照9例，外来犬咬伤者3例，没有1例是免疫犬引起的人狂犬病，表明家犬口服免疫对保护人群发生狂犬病具有十分显著的效果。

1.2CTN-1细胞疫苗(CTN-1Vero细胞疫苗)[21]将CTN-1毒种在Vero细胞传15代，病毒滴度达7.0～8.0 lgLD50/mL，收获病毒培养液加5%～10%小牛血清作为保护剂制成口服疫苗。

1.2.1疫苗对家犬的安全性 以8.0和6.5 lgLD50病毒液分别口服各10只犬(第一组)和6只犬(第二组)，另口服2只犬不含病毒的诱饵作为对照组，口服后每天观察犬的健康状况共28 d，并于5、10、20、60 d各杀3只(第一组2只，第二组1只)解剖观察病理变化并取脑和唾液腺分离病毒。结果观察期间全部犬均健全，未发现异常体征，2只健康未接种疫苗的对照犬，未发现由疫苗病毒传播的感染。脑和唾液腺经BHK21细胞和乳鼠脑传2代，均未分离到病毒。结果表明CTN-1疫苗对犬的口服接种是安全的，病毒并没有在口腔内复制并造成传播感染。

1.2.2疫苗对家犬的免疫性 以8.1 lgLD50免疫的8只犬，抗体全部达到0.5 IU/mL以上，阳转率100%，平均滴度2.59 IU/mL。以7.43 lgLD50免疫的4只犬，抗体阳转率为50%，GMT为2.48 IU/mL。对照犬抗体阴性，结果表明CTN～1株对犬有良好的口服免疫效果。

2 CTN-181疫苗[22-24]

CTN-181减毒株来自CTN-1株经KMB17人二倍体细胞传80代又经空斑克隆3次而获得，其毒力较CTN-1株极大降低，对4周龄小鼠、家兔、豚鼠脑内接种均不致病，乳狗肌内注射未死亡(0/16),近神经注射亦未死亡(0/5)，但对3周龄小鼠脑内仍有轻度致病力。崔君兆等[25]以CTN-181株在BHK21细胞培养制备的活疫苗，在广西灵川县对出生14 d以上的健康家犬肌内接种免疫。1980年共完成注射22 299头犬，免疫率93.52%。选择相邻的临桂县作为对照县，该县共有14 d以上家犬30 575头。免疫后观察1年，结果接种疫苗的犬全部安全未发生狂犬病症状，犬大规模免疫后对犬和人的狂犬病均有明显保护效果。

当年灵川县共发生人狂犬病9例，发病率3.73/10万。而免疫前1年(1979年7月至1980年6月)共发生25例，发病率8.69/10万，保护率64.0%，免疫前后对比有显著性差异(P<0.01)。未经免疫的临桂县同期共发生人狂犬病25例，发病率7.18/10万。二县对比，保护率为51.4%，差异有统计学意义(P<0.05)。对灵川县发生9例病人的分析，除1例由免疫犬咬伤外，其余7例均由未免疫犬或猫咬伤。据分析，虽然当时大规模免疫的免疫率高达93.5%，但以后不断进入当地的未免疫犬数量很多，易感家犬积累多，据调查免疫后的免疫犬减少到37.5%。因此有必要对新生或引进的家犬随时进行免疫才能更有效控制狂犬病的发生。另外疫苗免疫后对犬的保护，灵川县免疫前1年共发生犬狂犬病28例，发病率1.17%，免疫后发生12例，发病率0.5%，免疫前后对犬的保护率为65.4%。

3 CTN181-3株疫苗[26-27]

CTN181-3株毒种为CTN-181减毒株通过豚鼠颌下腺连续传3代后，经空斑克隆纯化1次，从19个毒力不同的病毒克隆株中筛选到1株对3周龄小鼠脑内不致病，免疫原性良好、遗传稳定性高的病毒株，命名为CTN181-3。以CTN181-3株在BHK21细胞培养，病毒滴度达到≥6.0 lgPFU/mL时制备活疫苗。

3.1CTN181-3株的毒力 CTN181-3株以高滴度病毒(>6.50 lgPFU/mL)脑内接种3周龄小鼠不致病，对2周龄小鼠的毒力亦显著下降(死亡40%～55%)，肌内或口腔感染3周龄小鼠亦均无致病性。较其母株CTN-181株对3周龄小鼠脑内致病的毒力更低。

3.2CTN181-3株的免疫性、抗体应答和保护效果 以5.6 lgPFU/mL病毒肌内或口腔免疫3周龄小鼠或地鼠1次，14 d后两种动物两种途径免疫的中和抗体阳转率均达到100%(GMT>1.34～12 IU/mL)。

3.3CTN181-3株的遗传稳定性 CTN181-3株的表型特性和分子特性均十分稳定: 1) 病毒通过乳鼠脑内传5代，病毒滴度在7.10 lgPFU/mL，脑内接种3周龄小鼠均不致病；2) 通过豚鼠颌下腺传4代，病毒滴度在6.48 lgPFU/mL，对小鼠脑内无致病性；3) 分别通过BSR细胞和vero细胞各传10代，病毒滴度在6.4和6.7 lgPFU/mL，对小鼠脑内或肌内接种均无致病性；4) 两种细胞各传10代后的病毒减毒基因均未发生回复突变。

以上结果表明CTN181-3株的毒力对3周龄小鼠脑内无致病性，对小鼠和地鼠口腔接种均无致病性，较其母株CTN-181株毒力进一步降低。特别是口腔免疫小鼠和地鼠1针，中和抗体100%阳转，GMT高达5～10 IU/mL，对小鼠攻击后的保护效果达100%，对地鼠为67%(免疫剂量太低，与小鼠相同均为0.1 mL)达到WHO对动物口服疫苗的实验室毒力要求。有待进一步对犬等大动物的安全性免疫性评价和田间实验。CTN181-3的亲本株CTN-1株已经对犬进行过口服免疫表明是安全的，CTN-181株已经在现场肌内接种家犬数万头证明是安全的，而CTN181-3株的毒力较其亲本株更低，因此其对犬的安全性应更可靠。因此，CTN181-3株疫苗是一种很有应用前景的动物口服候选疫苗。

4 SRV9株疫苗[28-29]

SRV9株毒种是用国外引进的SAD狂犬病毒减毒株经细胞3次空斑克隆，从数株克隆病毒中筛选得到。SRV9株的毒力较其亲本株SAD更弱，对18 g和12～14 g小白鼠的口服、皮下、脑内接种均不发病死亡，而亲本株仍有个别发病。SRV9株对乳鼠的脑内毒力亦明显降低，14～17 d龄乳鼠脑内感染病毒仅部分致死，18 d龄以上动物则不致死。SRV9对非靶动物如大鼠、豚鼠、梅花鹿、恒河猴肌内注射均安全。SRV9株对农村散养犬肌内接种900余只，经1年观察均未见异常。

SRV9株具有良好的免疫原性，对12～14 g断乳小鼠经口服、皮下、脑内接种免疫，1个月后的抗体阳转率除口服组1只外(1/5)其他组均阳转。同时，用狂犬病野毒肌内攻击，结果除皮下免疫组为80%外，其他组均为100%，而同时免疫的亲本株SAD的保护率仅为30%～70%。另外，以海绵诱饵疫苗口服免疫犬1 000只，抽检血清26份，阳转率为23/26(88.5%)。

SRV9株全长基因序列的测序结果表明，与亲本株SADB19相比，其158、575、971位碱基分别出现G→A，A→G和A→G的替换，导致第53、192、311位氨基酸出现Gly→Glu，His→Arg，Thr→Ala突变，该氨基酸的变化导致SRV9株毒力较其亲本株更低，免疫力更强。因此SRV9株的减毒具有明确的分子基础，可应用于疫苗质量和毒株毒力稳定性的监控[30]。

以上结果表明SRV9具有良好的安全性和免疫性，以常规免疫剂量5～10倍的病毒量肌内接种靶动物犬及非靶动物大鼠、豚鼠、梅花鹿及恒河猴均健康存活，无不良反应。经1 500多只犬口服免疫，未发现对公共安全有任何不良影响，免疫性良好，1次口服免疫动物80%～100%动物获得保护，毒力减弱具有明确的分子基础。因此SRV9株是一株很有开发前景的动物口服用疫苗的候选毒种。

5 ERAmg333疫苗

北京中联康生物科技股份有限公司对ERAmg333的安全性和免疫保护性做了系统的实验认证，并对制备的疫苗做了全面的检定，现将结果归纳如下：

5.1疫苗对动物的致病性 1) 疫苗对10～21 d龄小鼠脑内、口服、肌内注射均未发病；2) 对4周龄犬以高剂量(9.3 lgTCID50)口服或肌内接种，未观察到任何临床症状；3) 对5周龄裸鼠和CB-17SCID小鼠口服或脑内、肌内接种，二种免疫缺陷型小鼠均无致病性；4) 对鸡、兔子、猪等狂犬病非靶动物经口服和肌内注射均未观察到任何临床症状；5) 对灵长类动物的安全性，恒河猴超剂量口服后，观察90 d，无任何临床症状，唾液及粪便中均未分离到狂犬病病毒，解剖猴脑组织也未分离到狂犬病毒，HE染色未发现异常病理变化；6) 犬口服接种24 h后未发病，唾液及粪便等均无狂犬病病毒可检出。

5.2弱毒毒力的遗传稳定性 病毒经Vero细胞连续传23代，后又在3 d龄乳鼠脑内传5代，结果各代病毒对3周龄小鼠均无致病性，糖蛋白基因序列未发生改变，表明该毒株的毒力和遗传稳定性十分稳定，无毒力返强现象。

5.3免疫原性 口服免疫动物后以强毒株攻击的保护率为100%，结果与进口疫苗的肌内注射免疫对比，效果相同。但口服免疫途径较肌内注射简便可行而且安全。另外恒河猴口服接种后2周，中和抗体阳转率为80%，4周后达高峰。

以上结果显示ERAmg333毒种的毒力低，对多种动物不同途径感染均无致病性，遗传稳定性高，病毒经不同方法传代后毒力和基因未发生变化，适用于犬的口服途径免疫，是1株很有应用前景的犬用口服候选疫苗，制备的疫苗已经安全性、免疫性全面检定合格，该项目已于2016年3月顺利通过北京市科委的产业化项目验收。

6 基因重组狂犬病病毒株

武汉生物制品研究所朱家鸿团队以痘苗病毒天坛株为亲本株，将狂犬病毒的糖蛋白G基因插入天坛株的TK区，构建表达狂犬病糖蛋白的重组痘苗病毒。该病毒肌内免疫小鼠或狗二针后均可产生高滴度中和抗体(1∶200～1∶800)。2周后免疫小鼠用CVS固定毒和SW1街毒分别进行脑内和肌内攻击，结果两种病毒不同途径攻击保护率均达90%～100%[31-32]。以后又将狂犬病毒N和G基因同时插入构建成功同时表达N和G蛋白的双表达重组病毒，其中NGc-1双表达重组株对新生乳鼠的肌内毒力、成熟的脑内毒力和家兔皮肤毒力较其他重组株降低最大，对犬的免疫后产生高滴度中和抗体(1∶620)，以狂犬病街毒株SW1肌内攻击的保护率为100%[33]。

周明等[34]的一项研究将细菌的鞭毛蛋白基因克隆至狂犬病病毒的基因组中, 并拯救出重组病毒rLBNSE-Flic。为了比较rLBNSE-Flic和表达GM-CSF重组病毒(rLBNSE-GMCSF) 的免疫原性, 用这2 种重组病毒分别肌肉注射和口服免疫小鼠1针后, 同时以未插人任何基因的亲本病毒(rLBNSE) 作为对照。肌肉注射免疫的小鼠, 在免疫后3周采血测中和性抗体, 并用50 LD50CVS-24攻毒。口服免疫的小鼠, 在免疫后3周强化免疫, 强化免疫后1周采血测中和抗体并攻毒。与亲本病毒r LBNSE相比较, 无论是肌肉注射还是口服免疫, 重组病毒rLBNSE-GMCSF和rLBNSE-Flic都能产生较高滴度的中和抗体水平(24IU/ml)并具有较高的保护率。无论是肌肉注射还是口服免疫, 与亲本病毒rLBNSE相比较, 重组病毒rLBNSE-GMCSF 和rLBNSE-Flic是更有效的疫苗, 并通过实验证明其原因可能是由于招募和激活了更多的树突状细胞和B细胞，刺激产生更高水平的免疫应答。

郭霄峰等[35]的一项专利提到了一种狂犬病病毒重组毒株的制备，他们以狂犬病病毒株rHEP-Flury为骨架,分别将狂犬病毒G蛋白膜外抗原区基因片段及大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因插入rHEP-Flury的G基因和L基因之间的假基因区；拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP-Get-LTB。该狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB具有良好的复制能力以及安全性,通过Get和LTB基因的插入增强了疫苗株的免疫原性和黏膜免疫反应水平,口服免疫后可诱导较高水平的中和抗体,显著优于亲本株rHEP-Flury,可以作为动物狂犬病口服疫苗的候选株。

7 中国应用动物口服疫苗的紧迫性

世界卫生组织(WHO)、联合国粮农组织、世界动物卫生组织(OIE)以及全球狂犬病防控联盟等在2015年共同发起全球于2030年消除人间狂犬病[36]。其依据是全球已有50多个国家已经消除了狂犬病，他们的根本措施是加强犬的管理和对犬实施大面积免疫达到免疫率70%以上的措施。特别是一些国家以口服免疫方式对野生动物全面大规模免疫，切断野生动物狂犬病病毒传播感染犬而再度引起人间狂犬病的流行，达到最终消除狂犬病。其次是用于野生动物口服疫苗也充分证实对犬和其他靶动物十分安全有效。因此，有关国家只要采用WHO推荐的现有动物口服疫苗毒株或符合WHO制定质量标准和最低要求的毒株，结合注射用疫苗对犬实施口服免疫，提高犬的免疫覆盖率达到70%以上就可以消除本国的人间狂犬病[36]。因此WHO十分重视发展动物用口服疫苗，特别是安全性和免疫性的质量提高。目前已有多种减毒株可应用于动物口服免疫[1]。另外，随着科学技术进步，美国等发达国家还应用反向遗传学技术，对狂犬病病毒的基因组进行修饰改造而获得多株高度减毒株，如采用突变毒力相关位点、双联或三联突变G基因、插入增强免疫力的外源基因、基因缺陷减毒株等[37]。其中一株三联G基因株SPBAANGAS-GAS-GAS株对乳鼠脑内注射不致死，传代后毒力稳定未返祖，而且免疫性十分良好。小鼠经街毒感染后16、24、48、72h 肌内注射1剂该减毒株病毒，保护率分别达到90%、55%、40%、30%[38]。专家认为该减毒株的高度减毒和高免疫性有望用于人的暴露后治疗免疫，是狂犬病疫苗研究中的重大突破[39-40]。当然，这种高度减毒株对动物的口服免疫也是很有应用前景的。

基于这一提高犬免疫覆盖率的消除狂犬病的有效措施，一些国家如突尼斯、土耳其、斯里兰卡、菲律宾、南非共和国、摩洛哥等已经开始行动，对犬进行现场口服免疫的观察，其结果均显示疫苗都是安全的并具有提高犬的免疫覆盖率的优势，并可节省大量人力和时间而且对疫苗注射人员更安全。其中斯里兰卡以注射法免疫犬的最高覆盖率只有60%而口服免疫可提高到71%；在土耳其59%散在犬无法注射免疫但可以通过口服免疫；菲律宾的观察结果口服免疫对犬的免疫覆盖率可达76%，1个月后抗体阳转率可达71%[41-46]。

然而，中国的狂犬病防控措施多年来一直是加强对暴露后人群免疫，包括大量生产疫苗，提高疫苗质量，增强群众对暴露后免疫的意识，以及正确处理暴露后免疫措施等。这些措施对中国的狂犬病例下降也起到重要作用，人狂犬病例从以往的千例以上降到每年500多例，这一成果应归功于卫生部门的疫苗生产、质量控制和各级疾病控制中心的共同努力，但没有根本改变中国狂犬病的现状。而且疫苗的使用量并没有减少，2018年的人用狂犬病疫苗的签发量仍高达1 500万人份，病例虽有所下降但人被犬致伤的数量并没有下降，根本原因是大量疫苗用于人而没有用于犬。也说明农业部对犬缺乏有效的监管和免疫措施。中国狂犬病疫苗的产量(人份数)已超过全球80%的份额，疫苗和免疫相关费用高达近100亿元，付出的代价是世界第一，但狂犬病的病例数量是世界第二，死亡人数高居各类法定报告传染病前列，仅次于艾滋病和结核病。因此不采取国际上控制消灭狂犬病的有效措施，即对犬加强管理和免疫率达70%以上以及野生动物的口服免疫的措施，仅依靠对人的暴露后免疫，狂犬病的下降速度是很慢的，很难达到完全消灭。中国人口规模大而养犬数量多，据不完全统计约为1亿头而犬的免疫率不到20%，而农村的狂犬病发生率最多，但犬的免疫率却最低，据新华网报道：新华每日电讯记者调查发现，在城市办理养犬证和动物疫苗接种等规定流于形式，疫苗接种并没有完全到位；在农村，犬的疫苗接种率极低，记者走访的几个村庄散养犬不少，但养狗者都没有听说过要给狗打疫苗。我国狂犬病病例绝大多数发生在农村，但各方数据显示，农村散养犬的疫苗接种率可能只有一到两成[47]。

犬免疫率低的原因主要是主管犬的农业部门对犬的管理和免疫缺乏有效措施，实际上国际上普遍认为仅以注射方式给大量散养犬、无主犬注射存在许多困难，达到70%免疫率难度很大。因此科学家发明的以口服方式给犬和野生动物免疫是“一项创新性突破”。

其实，中国老一代知名科学家如兽医界殷震院士、侯世宽、高云教授，人医界崔君兆、褚菊仁、严子林教授等，在国外动物口服疫苗的成功经验启发下，早在20世纪80年代就已着手研究动物用口服疫苗减毒株，并进行了实验室和现场的犬口服疫苗评价实验。

但是早期筛选和应用的毒株对小鼠的脑内毒力仍然较高，存在潜在危险性，中国科学家们又进行了对病毒株的继续减毒纯化筛选，结果目前获得几株毒株都是毒力很低，不但对小鼠脑内接种或口腔接种无致病性，而且通过乳鼠脑内传5代或细胞传10代，各代病毒对小鼠脑内仍无致病性，而且减毒的基因全部没有发生回复突变，表明其不但毒力高度减弱，遗传稳定性也十分稳定，不可能产生传播感染。其表型和基因型特性与WHO认可并在国际上广泛应用于口服免疫达20多年，证明安全有效的SAG2株减毒活疫苗相似或接近[5]。特别是CTN181-3株，其原始母株(CTN-1株)是较近时期(1955年)分离自国内的狂犬病野毒株，其全基因序列较其他国内外疫苗株病毒更接近于国内当前狂犬病流行株病毒[48]。CTN181-3株的全序列测序和对比也表明更接近与国内分离株，因此更适用于预防中国的狂犬病流行株的感染。

因此，以上这些毒株都是很有应用前景的候选疫苗毒株，2030年全球消除人间狂犬病，这个任务十分艰巨，不着手对犬的加强管理和免疫接种是难于完成任务的。以往中国犬用疫苗为减毒活疫苗，其减毒株毒种为Flury LEP和ERA株，残余毒力仍然较强，对小鼠有致病性[2,18]，特别是Flury LEP株对幼鼠肌内感染有致病性，脑内毒力高达4.0lgLD50[22],因此有可能发生免疫犬的病毒传播到自然界感染动物和人[49]。禁止应用这类活疫苗是正确的，但是现在WHO认可和国际上通用的减毒株要求毒力高度减弱，不但对小鼠脑内注射不发病，在乳鼠脑内和细胞培养传代多次后，弱毒保持稳定没有回升，遗传稳定性十分稳定。国外大量应用也没有发现疫苗株弱毒返祖传播外界环境的现象，因此对这类减毒株不应笼统禁止应用。灭活疫苗的免疫持久性短，需多次注射，且给大量散养犬、无主犬注射难度大，还经常发生被注射犬伤人的不安全现象，因此对养犬数量大的国家以注射方式达到70%以上的免疫率是十分困难的。当前唯一可行提高免疫率的措施应该是在注射灭活疫苗的免疫基础上结合减毒活疫苗的口服免疫。

特别是中国的实际情况是犬的数量大，注射免疫达70%覆盖率的难度大，口服免疫是唯一可行的提高免疫率的措施，另外在人间狂犬病得到基本控制后，为避免野生动物狂犬病的传入而再度发生人间狂犬病，也必须对野生动物及时实施大规模的口服免疫措施，切断野生动物狂犬病传染源，才有可能达到持久稳定的消除中国人间狂犬病，因此中国消除狂犬病，对犬和野生动物的口服免疫是一项必不可少的重大措施。国家应有紧迫感，抓紧研制犬口服疫苗和应用。其实犬口服疫苗的应用对中国控制和消灭狂犬病的重大作用，我国著名兽医学专家殷震院士早在上世纪80年代就提出“狂犬病口服免疫，简便、易行，一旦推广，不仅可大大提高对犬的免疫覆盖率，还可为野生动物狂犬病预防提供良好前景[28]”, “我们相信口服免疫的方式可能成为消灭狂犬病的最佳途径[50]。”

最近世界狂犬病知名专家，WHO狂犬病官员Cliquet F、Meslin和Rupprech 教授署名发表文章指出[51]“犬的口服免疫是一项经充分研究过的，但作为消灭人间狂犬病的工具仍被低估”，并强调“发展中国家应更明智地应用犬口服免疫(OVD)帮助完成2030年全球人狂犬病为0的目标”。新华网总结国内才学鹏、俞永新、涂长春等权威狂犬病研究专家认为，首先要关口前移，强化兽医部门在狂犬病防控中的核心作用，在全国实行犬的狂犬病强制免疫制度。加强狂犬病的科学研究、成果转化和应用，大力鼓励、支持有条件的单位和企业开展犬用狂犬病口服诱饵疫苗，使犬的接种率快速达到70%以上的国际公认水平，阻断病毒在犬之间的传播。

2018年最新一次的WHO专家委员会报告[1]已进一步将犬的口服免疫提上了议程，明确指出一些国家在犬的大规模注射免疫中无法达到70%免疫覆盖率时应考虑把犬的口服免疫纳入本国消除狂犬病的策略中。同时对犬口服疫苗的质量标准做了具体规定，对国家批准犬口服疫苗用于现场的要求和办法也做了建议，这些建议对我国当局及时和加速批准中国犬用口服疫苗的应用很有指导和参考意义。

7 结 语

狂犬病的控制和消灭，加强犬的管理和大面积免疫是消除我国狂犬病的核心策略和根本措施，而犬的口服免疫是提高犬免疫覆盖率能够达到70%以上最有效的手段。WHO已明确犬口服免疫疫苗对消除狂犬病的重要意义并已制定疫苗的质量标准和批准应用的建议，中国已有犬口服疫苗的候选毒株和现场应用的经验，国家应充分支持这些毒株进一步完善，以及对犬和其他大动物的扩大实验和田间现场观察，尽快投入生产和实际应用。但完成这一阶段困难还是很大的，应有农业部的重视和大力支持，国家财政划拨狂犬病防治专项经费的投入。

利益冲突：无