腺病毒载体用于动脉粥样硬化基因治疗的研究进展

王琳 张珂欣 刘艳稳 冷吉燕 秦俊杰

(吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

除了大约20年前进行的一项关于低密度脂蛋白受体基因预防家族性高胆固醇血症患者早期动脉粥样硬化的预实验〔1〕，目前对动脉粥样硬化的基因治疗仍然停留在临床前阶段。潜在的动脉粥样硬化基因治疗包括操纵血浆脂蛋白通过基因转移到肝脏和直接基因转移到血管壁防止或逆转动脉粥样硬化病变生长。本文将探讨腺病毒载体用于动脉粥样硬化基因治疗的研究进展。

1 腺病毒介导的静脉移植治疗动脉粥样硬化

多年以来，心血管疾病一直是导致死亡、残疾的最主要原因，尤其是动脉粥样硬化导致的心脏病〔2,3〕。动脉粥样硬化的发病率和死亡率最主要原因是累及冠状动脉，其中内膜脂质和炎性细胞的积累导致管腔狭窄、血流减少、血栓性闭塞，并伴有胸痛、心肌梗死、心力衰竭和猝死等相关症状〔4〕。尽管经皮冠状动脉介入治疗(如血管成形术和支架植入)取得了进展，但冠状动脉旁路移植术(CABG)仍然是治疗严重冠状动脉疾病的主要方法〔5～7〕。因此，各个国家每年均仍有数以万计的CABG手术〔8〕。然而，构建CABG的大隐静脉段的高闭塞率却限制了CABG的长期益处。CABG静脉移植通畅率1年估计为80%，10年估计为50%〔9，10〕。

目前用于预防移植静脉粥样硬化的药物主要为降脂药物，以他汀类药物为代表〔11〕。他汀类药物在绝大多数CABG受者中都有应用，然而，没有证据表明广泛使用他汀类药物会增加静脉移植的通畅率，也有证据表明通畅率正在下降〔12〕。此外，他汀类药物治疗仅在一定程度上是有效的：他汀类药物诱导低密度脂蛋白胆固醇降低到<100 mg/dl，可增加移植血管通畅；然而，进一步降低到<70 mg/dl，则没有额外的好处〔13〕。移植静脉粥样硬化可通过动脉旁路移植而避免，如左胸内动脉10年通畅率>95%。然而，任何一个CABG患者只有一个左侧胸内动脉，但几乎所有的CABG患者都需要超过1个旁路血管。与仅使用左胸内动脉和静脉移植相比，使用左胸内动脉和右胸内动脉进行旁路移植术并不能改善心血管结果，而且与胸骨伤口感染显著增加有关〔14〕。桡动脉偶尔也被用作CABG导管；然而，他们的长期通畅率和相关的临床结果并不优于静脉移植〔15〕。

如今，很多专家提出了基因疗法，作为一种很有前途的方法预防静脉移植物粥样硬化〔16，17〕。基因治疗静脉移植物粥样硬化将包括在移植物本身中表达一种治疗性基因，该基因被选择用于防止脂质积聚、炎症或血管重构，这些因素被证实是导致动脉粥样硬化快速发展的原因〔18〕。然而，动脉粥样硬化的基因治疗进展长期受到转基因持久表达需要的限制，而这一点可能是预防疾病进展发展的必要条件。最近有报道表明，用辅助病毒依赖型腺病毒载体(HDAd)转导的兔静脉移植至少在24 w内产生转基因表达，4 w后稳定表达〔19〕。用同样HDAd转导的家兔动脉达到转基因表达至少需要48 w，稳定表达仍需4 w〔20〕。因为HDAd似乎能够介导血管中转基因的持久表达，所以HDAd是一种很有前途的载体，可以进一步开发用于血管移植物粥样硬化的基因治疗。

2 腺病毒载体介导的前胸腺素-α基因转染抑制动脉粥样硬化

氧化应激是由于抗氧化剂减少或活性氧(ROS)过量生成造成的，被认为是内皮功能障碍的发病机制和动脉粥样硬化起始与进展的主要机制。清除血管内ROS并抑制一氧化氮(NO)降解的防御机制包括酶促过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶以及非酶促低分子团。NO是主要的血管扩张剂，是通过内皮NO合成酶(eNOS)合成的。超氧化物通过与血管NO反应或减少血管NO生物利用度来促进细胞损伤。由于超氧化物的血管水平受SOD调控，因此，SOD基因在心血管疾病中的作用具有重要意义。

Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Keap)1和核因子E2相关因子(Nrf)2是氧化应激的重要细胞传感器。在无应激细胞中，Nrf2通过与抑制蛋白Keap1结合被隔离在细胞质中，然后通过蛋白酶体系统被降解。在暴露于亲电性与氧化应激下，Nrf2从Keap1中释放，然后转移到细胞核中，与Maf形成杂二聚体，并与抗氧化反应元件(AREs)结合，调控ARE介导的基因表达。之前有研究表明，前胸腺素α(ProT)能够将Nrf2从Nrf2-Keap1抑制复合物中释放出来，调节氧化应激保护基因的表达。ProT是一种高酸性的小蛋白质，分布在多种组织的细胞核中，在哺乳动物中高度保存。许多研究〔21，22〕都显示了ProT的免疫调节功能，包括增强人类主要组织相容性抗原(MHC)Ⅱ类表面抗原在抗原递呈细胞上的表达及人类自然杀伤细胞的细胞毒性。此外，ProT可能对转录有更广泛的影响，它影响特定转录因子的活性，包括雌激素受体和信号转导与转录激活因子(Stat)3。

在一些研究〔23〕中，人们使用表达ProT(指定AdProT)的腺病毒检测ProT基因转染对抗氧化基因表达的影响，从而研究ProT介导的内皮细胞在体外和体内氧化损伤的保护作用。

3 腺病毒载体介导的鞘磷脂合成酶2增加动脉粥样硬化损伤

鞘磷脂(SM)参与了许多重要的生物学功能，包括细胞膜的形成、信号转导和脂质代谢，这些都与动脉粥样硬化的发展有关。SM是主要的磷脂之一。血浆膜SM和SM/(PC)比值是冠心病的独立危险因素；此外，这些脂质在人类和动物模型的动脉粥样瘤中积累。先前的研究〔24〕表明，从人类动脉粥样硬化病灶中提取的低密度脂蛋白(LDL)富含SM，载脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠的血浆SM水平比野生型小鼠高4倍，这可能在一定程度上解释了这些小鼠动脉粥样硬化的增加。血胆固醇高的家兔的极低密度脂蛋白(VLDL)中SM水平增加了5倍。作为SPT的抑制剂(SM生物合成途径的第一关键酶)，肉豆蔻素的使用显著降低了ApoE 敲除小鼠的血浆SM水平和动脉粥样硬化病变。这些数据表明，升高的血浆SM水平可以促进动脉粥样硬化的发生。鞘磷酸酶(SMS)是SM生物合成的最后一种酶，具有SMS1和SMS2两种亚型。有实验表明，SMS1和SMS2的过表达增加了小鼠的脂蛋白动脉粥样硬化潜能，促进了细胞凋亡。动脉粥样硬化是由动脉粥样硬化性脂蛋白与动脉壁相互作用引起的，许多过程都与早期的动脉粥样硬化有关。其中，脂蛋白的保留和聚集是关键步骤。近年来有研究〔25〕生成含有人类SMS2 cDNA和绿色荧光蛋白(GFP)cDNA的重组腺病毒载体，并将重组腺病毒载体静脉输注给ApoE基因敲除小鼠，结果表明，SMS2过表达在动脉粥样硬化形成中发挥一定的作用，并且提供了直接的形态学证据，表明SMS活性升高可以促进小鼠动脉粥样硬化。

4 前蛋白转化酶/枯草杆菌蛋白酶9型编码重组腺相关病毒载体诱导动脉粥样硬化形成

动脉粥样硬化可通过生殖系基因工程在动物体内实现，导致高胆固醇血症，但这类模型局限于少数物种和菌株，很难与涉及基因操纵或变异的其他强大技术相结合。为了建立无种系遗传工程的动脉粥样硬化的诱导方法，近年来有研究将设计重组腺相关的病毒载体用于编码功能获得性前蛋白转化酶/枯草杆菌蛋白酶9型突变体，并给予小鼠静脉注射载体，然后进行高脂饮食喂养。结果表明：单一注射前蛋白转化酶/枯草杆菌蛋白酶9型编码重组腺相关病毒载体是一种快速、通用的动物动脉粥样硬化诱导方法〔26〕。这种方法对于高通量或涉及遗传技术、毒株或与现有的基因工程模型不能很好结合的物种的实验能够起到重要作用。

近些年来，腺病毒载体在动脉粥样硬化基因治疗的应用上确实取得了显著的进展。随着对腺病毒分子生物学研究的进一步深入及人们对动脉粥样硬化发病机制的全面了解，在未来必将有满足需要的腺病毒载体引入临床，为心血管系统疾病的治疗提供新思路。