斑马鱼胚胎背腹轴建立的分子机制

闫一芳，王强*

(1. 中国科学院动物研究所，膜生物学国家重点实验室，北京 100101； 2. 中国科学院大学，存济医学院，北京 100049)

在斑马鱼胚胎中，随着原肠期胚胎的外包、内卷、汇聚和延伸等运动使整个胚胎细胞按照准确有序的运动进行重新排列，胚胎背腹轴、前后轴和左右轴线的建立，使三胚层诱导生成的各个组织器官沿着三个轴线进行相对准确的定位。就背腹轴而言，各组织器官的前体细胞沿胚胎的背腹轴线分布，所处胚胎的位置不同，具有不同的发育命运，例如位于背侧的轴线中胚层前体细胞将发育为脊索和脊索板，而分布在腹侧的中胚层前体细胞则最终发育为血液等。在斑马鱼胚胎中，背部组织中心指导背腹轴的正确形成，对胚胎早期形态构建至关重要。阐明体轴建立的分子机制，对于深入了解胚胎早期发育机理有着重要的科学意义。

1 背部组织中心简述

在20世纪20年代，德国胚胎学家Hans Spemann将两栖类动物(蝾螈)原肠胚胚孔背唇细胞，移植到另一枚胚胎的腹侧。他们发现随着发育的进行，移植的胚孔背唇细胞可以诱导宿主胚胎腹侧细胞形成包括中枢神经系统在内的第二体轴[1-2]。这些具有诱导作用的胚孔背唇细胞被命名为Spemann’s organizer，Hans Spemann本人也于1935年荣获诺贝尔生理或医学奖。1933年，英国学者C.H. Waddington发现将供体鸭胚的原结移植到发育时期相同的寄主鸡胚的上胚层之后，同样可以诱导形成次生胚[3-4]。大约60年后的1998年，日本科学家发现鸡胚中的亨氏小结以及斑马鱼胚胎胚盾期的胚盾(embryonic shield)均可诱导出第二体轴[5]。同时期，美国、英国多位发育生物学家发现，将7 d小鼠胚胎的原结移植到受体胚胎的后外侧，同样可诱导形成第二体轴[5-7]。2018年，美国洛克菲洛大学的Ali h. Brivanlou研究组将人类胚胎干细胞移植至鸡胚中，首次验证了人体细胞背部组织中心的存在[8]。因此，脊椎动物胚胎的背腹轴建立，存在进化上保守的结构和过程。

2 母源 Wnt/β-catenin 信号调控背部组织中心形成的分子机制

两栖类动物胚胎受精时由于精子进入卵的影响，卵子皮质与卵黄在重力作用下进行移动，发生皮质旋转(cortical rotation)，一些定位在植物极、含有调控背部组织中心形成的因子开始在预定胚胎背部区域积累，产生有色素差异的灰色新月区(gray crescent)[9]。这个灰色新月区产生的细胞随后发育成为胚孔背唇，开始原肠作用，并在原肠期产生有规律的细胞重排及相互诱导，发育成为背部组织中心(dorsal organizer)。

科学家移除早期斑马鱼胚胎受精卵的植物极后，发现胚胎缺乏神经组织和背部中胚层等背部组织，胚胎呈明显的腹部化表型，表明斑马鱼胚胎植物极存在某种背部决定因子[10]。随后的研究发现，在斑马鱼受精卵中，定位在植物极的背部决定因子通过微管系统以不对称转运的方式向动物极胚盘运输。编码驱动蛋白连接分子蛋白的基因syntabulin，其突变体tokkaebi胚胎因无法形成微管将母源因子顺利转运至预定背部区域，导致背腹轴缺陷[11-12]。在卵子产生过程中，Balbiani小体(Balbiani body)在紧邻细胞核的植物极一侧产生并迁移到预定植物极底部，然后裂解、释放其包含的mRNA和蛋白，这其中就有母源表达的背部决定因子。接着， syntabulin和kinesin I以微管蛋白束依赖的方式将背部决定因子转运到预定背部区域[13]。

2.1 Wnt/β-catenin信号通路简介

Wnt最开始因果蝇中wingless基因的一个突变导致的无翅膀表型被发现，目前已知超过19种Wnt配体[14]。经典Wnt信号通路主要是对其关键的效应分子β-catenin的调控。当没有Wnt信号的时候，Axin、APC(adenomatous polyposis coli protein)、CK1(casein kinase 1)和GSK-3β(glycogen synthase kinase-3β)组成的降解复合物在细胞质和β-catenin结合，GSK-3β和CK1将其N端磷酸化，而N端磷酸化的β-catenin会被E3泛素连接酶β-TrCP(β-transducin repeat-containing protein)识别然后导致其通过蛋白酶体途径降解。而Wnt配体和受体Frizzled以及辅助受体LRP6(lipoprotein receptor-related protein 6)结合后，GSK3-β或者CK1会将LRP6胞内端磷酸化，然后Axin在Dvl (Dishevelled)依赖的方式上膜结合LRP6，从而有效抑制降解复合物的活性使β-catenin变得稳定并进入细胞核，代替核内抑制因子Groucho与转录因子TCF/LEF结合，调控靶基因的转录[15-16]。

2.2 Wnt/β-catenin信号在背腹分化过程中的作用

脊椎动物胚胎中，母源 Wnt/β-catenin 信号起始组织中心诱导。2005年，美国辛辛那提儿童医院Tao 等发现，使用反义寡核苷酸MO(morpholino)敲低非洲爪蟾胚胎的Wnt11，引起胚胎背部组织发育缺陷[17]。两年以后，该实验室的Matt Kofron的研究表明，Wnt11可通过其辅助受体LRP6激活信号通路，从而确定胚胎背部命运[18]。但是，在2000年，哈佛大学医学院贺熹教授实验室的研究，发现在爪蟾胚胎中过表达显性失活形式(dominant negative)的LRP6突变体，在受体水平上抑制Wnt信号通路，并不会导致胚胎背腹轴缺陷[19]。

2011年，美国弗吉尼亚大学Bernard Thisse实验室在《美国科学院院报》撰文，认为Wnt8a是斑马鱼胚胎背部组织形成的决定因素[20]。2018年，日本名古屋大学Masahiko Hibia实验室通过转录激活子样效应核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)技术制备了斑马鱼母源Wnt8a突变体，发现缺失母源Wnt8a并没有明显影响胚胎背腹轴建立[21]。由此看来，在脊椎动物胚胎背腹轴建立过程中，Wnt蛋白配体可能并不是真正的背部决定因子，而且β-catenin信号的激活似乎与Wnt配体及其跨膜受体无关。2018年，清华大学生命科学学院孟安明院士研究团队，与该学院陶庆华教授实验室合作，首次报道了一个斑马鱼母源突变体“葫芦娃”(Huluwa, HWA)，发现 Huluwa 蛋白定位于囊胚早期预定背侧细胞的细胞膜上。缺失胞外结构域的“葫芦娃”蛋白突变体仍具有指导背腹轴建立的功能，表明其功能发挥可能不需要胞外信号。Huluwa 蛋白在不依赖于Wnt配体与受体的情况下，促进β-catenin在胞质中稳定，进而转运到核内，决定背部命运与体轴形成[22]。

β-catenin对于斑马鱼的组织中心胚盾的形成和背腹分化至关重要，缺失β-catenin的突变体ichabod胚胎背部组织中心无法正常形成，导致背腹轴的建立严重缺陷[23-24]。我们的相关研究结果发现，鸟苷酸因子Net1激活RhoA家族的G蛋白，干扰PAK1二聚体的形成，激活PAK1激酶活性，从而磷酸化β-catenin 675位丝氨酸，抑制β-catenin与组蛋白去乙酰化酶HDAC结合，促进Wnt靶基因转录，在胚胎背部组织中心形成和背腹轴建立过程中发挥重要作用[25]。母源Wnt信号激活的β-catenin促进背部特异基因的转录，包括squint、goosecoid、bozozok和chordin(chd)等，诱导背部组织中心的形成[26]。而合子期Wnt信号与BMP信号共同调控vox/vent/ved转录抑制因子的表达，抑制背部组织中心发育[27-30]。

3 BMP信号调控背腹轴建立的分子机制

3.1 BMP 信号通路简介

骨形态发生蛋白(BMP)最早由于其诱导异位骨形成被鉴定出来，是一类归属于转化生长因子(TGF-β)超家族的多功能胞外分泌蛋白[31-32]。迄今共发现20多种结构功能相关BMP，大多在胚胎发生和器官形态发生方面起着重要作用。BMP包括果蝇体内的Decapentaplegic (Dpp), Screw (Scw)和Glassbottom-boat (Gbb)，以及脊椎动物体内的BMP2/4, BMP5/6/7/8和BMP-9/10等[33-35]。BMP蛋白配体在细胞表面形成二聚体结合到BMP I型和II型受体上，随后组成型激活的II型受体磷酸化激活I型受体, I 型受体招募并磷酸化BMP信号通路胞内效应蛋白Smad1/5/8[36-37]。磷酸化的Smad1/5/8与Smad4形成复合体，然后转运至细胞核内，调控BMP靶基因的表达[37-39]。

3.2 BMP 信号通路与背腹轴建立

在斑马鱼胚胎中，bmp2b和bmp7a最初表达在中囊胚期转换后不久的整个胚盘，形成异二聚体以激活Smad1/5/8[40]。在囊胚晚期及至原肠胚初期，位于背部区域的BMP很快会被BMP拮抗因子chordin所抑制，使得BMP形成腹部浓度高而背部浓度低的浓度梯度。缺失Bmp2b、Bmp7和I型受体Alk8以及转录的效应因子Smad5均导致胚胎的背部化[41-44]。在bmp2b的突变体swirl中，胚胎背部化严重，注射爪蟾BMP4 mRNA或者斑马鱼bmp2b均可挽救这种背部化表型[44]。在bmp7 的突变体snailhouse中，胚胎同样有严重背部化的表型，外源的爪蟾BMP7和斑马鱼bmp7均可以挽救这种表型[42, 45]。在BMP拮抗因子chordin的突变体choidino中，胚胎呈腹部化表型，且bmp2b表达范围扩大[28]。敲低斑马鱼中的表达在胚盾的BMP配体Admp(anti-dorsalizing morphogenetic protein)的表达，致使胚胎有轻微背部化表型[46-47]。在BMP信号I型受体ALK8的突变体lost-a-fin中，胚胎也是严重背部化表型，但位于其上游的bmp2b或者bmp7 mRNA都不能挽救这种表型，而是位于其下游的smad5 mRNA可以挽救[41, 48]。同样的，在BMP信号通路下游Smad5的突变体somitabun中，胚胎也有背部化表型[43]。蛋白磷酸酶Ppp4c通过与Smad1/5直接互相作用，增强BMP靶基因的转录而促进BMP信号的转导，是一个BMP信号的正向调控因子，促进胚胎早期的腹部组织发育[49]。

在斑马鱼背腹分化过程中，BMP信号浓度梯度的形成受到一系列分泌因子的调控，包括背部分泌的BMP拮抗因子chordin、noggin1和follistatin-like 1b，腹部分泌的BMP信号的调控因子Bmp1a、Twsg1a、Crossveinless 2和Sizzled等。例如，chordin的突变体choidino胚胎呈腹部化表型[28]。Crossveinless2，编码蛋白为CV-2，表达在原肠胚期胚胎的腹部，可以增强BMP信号[50]。

4 参与斑马鱼胚胎背腹轴建立的其他信号通路

脊椎动物的背腹分化是一个需要多条信号通路精确调控的过程。在爪蟾中，Nodal与母源β-catenin共同调控背腹轴的起始。爪蟾胚胎处于4000细胞时期时，位于植物极的母源因子VegT激活合子信号，这些合子信号则诱导组织中心的形成，调控背腹分化[51]。VegT编码T-box转录因子，在卵母细胞和受精卵中定位在植物极， VegT激活的合子信号一般指TGF-β超家族成员的Derrière和Nodal相关基因Xnr1、Xnr2、Xnr4、Xnr5 和Xnr6，这种激活诱导组织中心的形成，确定背腹轴的形成[52-54]。另一个母源表达的TGF-β超家族成员Vg1也是Xnr1和Xnr2表达所必须的，实验表明，使用显性抑制形式(dominant negative)的突变Vg1会导致背部中胚层有缺陷[55]。

斑马鱼胚胎Nodal基因squint和cyclops参与了背腹分化。研究发现Squint蛋白是长距离作用因子，而Cyclops作用距离相对较短。原肠胚期，母源 Wnt 信号激活 Squint在背部高水平表达诱导背部中内胚层形成， 相对低浓度的 Nodal 信号与其他信号一起诱导腹部中胚层形成。

FGF信号在背腹分化过程中的主要作用是抑制BMP信号[56]。在斑马鱼中，囊胚期时fgf3/fgf8/fgf24主要表达在背部边缘细胞，抑制背部表达的bmp2b和bmp7[56-57]。单独缺失fgf8不足以使胚胎有腹部化表型，不过它的缺失可以增加chordin突变体的腹部化[57]，表明FGF8与其他的FGF蛋白有功能冗余。同时，在缺失FGF信号时，β-catenin不能单独挽救icbabod突变体的表型[58]，表明β-catenin下游需要FGF信号一起来诱导组织中心的形成。

5 展望

近年来的随着发育生物学研究领域的迅猛发展，胚胎背腹轴建立的分子机制越来越详尽和清晰。但是还有以下重要的问题需要进一步的探索。在母源Wnt信号激活机制方面，背腹决定因子如Huluwa如何进行不对称运输，与何种细胞器的转运相关等问题还没有清晰的阐释。另一方面，BMP浓度的形成总是受到来自信号通路各个组分水平变化、温度差异、大小不同，甚至子代细胞中的不对等分配等因素的干扰。但事实上， BMP浓度梯度的形成以及胚胎的背腹轴建立过程具有很强的发育稳定性，可以对抗信号通路活性的波动。目前对BMP浓度梯度和背腹轴发育稳态的分子机制所知甚少。对于这些重要科学问题的回答，将极大促进我们对于胚胎背腹轴建立的分子机制的理解。