Wnt信号通路在视网膜干细胞修复中的作用

杨 琨，王 雁

天津市眼科医院 天津医科大学眼科临床学院 天津市眼科研究所 天津市眼科学与视觉科学重点实验室，天津 300020

视网膜的退行性病变，如青光眼、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)等，均可导致不可逆的视力损伤。在胚胎发育过程中，视网膜与中枢神经系统一样都是由神经外胚层的细胞发育而来，成年哺乳动物的视网膜曾一度被认为损伤后无再生修复能力，然而近年研究发现，成年哺乳动物的眼中存在沉寂的视网膜干细胞(retinal stem cells，RSCs)，这些干细胞在一定条件下可以被激活并分化为视网膜神经元而修复损伤的视网膜[1- 4]。Wnt信号通路是传递生长刺激信号的重要通路，研究表明，Wnt信号通路在视网膜的发育过程中起着重要的调控作用，在视网膜神经元的分化以及维持其神经元特性方面发挥重要作用[5]。

Wnt信号通路

Wnt最初是从乳腺癌小鼠中克隆出来的原癌基因int- 1，由Nusse等[6]在1982年发现并报道，后续研究发现，果蝇无翅基因Wg与int- 1的基因序列具有高度的同源性，因此将二者合称为Wnt。Wnt蛋白家族广泛存在于多细胞真核生物中，是一条高度保守的信号通路，通过自分泌或旁分泌在胚胎发育过程中发挥重要作用[7]。

经典的Wnt信号通路为Wnt/β-catenin途径。Wnt在细胞上的受体是卷曲蛋白(frizzled，Frz)，Frz胞外n端具有富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain，CRD)，能与Wnt结合，其辅助受体为低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP)5/6。Wnt蛋白与细胞膜上的Frz及LRP5/6受体结合，作用于胞质内的蓬乱蛋白(dishevelled，Dsh)，活化后的Dsh抑制由轴抑制蛋白(axis inhibition protein，Axin)、结肠腺癌息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)和糖原合成激酶- 3β(glycogen synthase kinase- 3β，GSK- 3β)三者共同形成的降解复合物Axin-APC-GSK- 3β与β连锁蛋白(β-catenin)的结合，从而切断细胞质中β-catenin的降解途径，使β-catenin在细胞质中积聚并进入细胞核，与细胞核内的T细胞因子(T cell factor，Tcf)/淋巴细胞增强因子(lymphoid enhancer factor，Lef)转录复合物结合，调节C-myc、Cyclin D1、Ngn- 2等靶基因的转录和表达，调控细胞的增殖和分化。研究表明，Wnt/β-catenin参与的信号转导途径传递着多种细胞生长刺激信号，特别是在神经系统的发育过程中，能够明显促进多种神经干细胞的增殖和分化[5，8]。

Wnt信号通路调控着视网膜的干细胞修复

Wnt信号通路通过其受体、配体和调节子的有序表达来调控RSCs的增殖和分化[9- 10]。对斑马鱼的研究显示，Wnt信号上调可导致β-catenin在细胞内积聚，促使视网膜细胞重新去分化进入细胞周期而修复损伤视网膜，同时，β-catenin还能与性别决定区域Y-框2(sex-determining region Y-box 2，Sox2)通过协同作用促进视网膜胶质细胞去分化的过程，因此鱼类的视网膜损伤后，在Wnt信号通路的作用下，能有效修复损伤的视网膜，恢复视功能，两栖类动物的视网膜修复过程也和鱼类相类似[11- 12]。一般认为，这种视网膜自我修复的功能只存在于两栖类和鱼类等低等脊椎动物中，然而最近研究发现，在小鼠的视网膜中，Wnt通路激活后，其视网膜神经元也可以重新回到视网膜祖细胞的状态，随后通过加入外源性造血干细胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs)后，可以使这些视网膜祖细胞向视网膜神经元分化，最终发育成终末分化的神经元[13]。这种通过上调信号通路及干细胞融合介导的细胞重编程能否成为一种组织再生的潜在机制还有待进一步研究。

研究显示，视网膜的损伤可能会激发其干细胞的潜能而进行自我修复，为了研究视网膜损伤后细胞修复的情况，Han等[14]通过激光光凝的方法破坏小鼠视网膜色素上皮细胞(retinal pigmentosa epithelial，RPE)，发现Wnt通路的靶基因Cyclin D1、Otx2和Mitf的表达水平出现反应性增高，其中，调控RPE细胞增殖的关键转录因子Otx2和Mitf的表达与Wnt信号的上调呈正相关，该研究表明，Wnt信号在RPE增殖修复的过程中发挥了重要的促进作用，通过操控Wnt信号的表达水平有可能激发RPE细胞的干细胞潜能，实现RPE细胞的再生治疗。

最新研究证实，作为哺乳动物视网膜中最主要的胶质细胞，Müller胶质细胞(Müller glia，MG)在特定条件下也可以去分化而修复损伤的视网膜[15- 16]。MG细胞的增殖及其干细胞潜能是由经典的Wnt/β-catenin通路通过Lin28/let- 7 miRNA途径调控的[17- 18]。视网膜损伤后，Wnt/β-catenin通路因细胞质中的β-catenin积聚而激活MG细胞的增殖，与此同时，β-catenin在通路的下游与Lin28启动子结合并激活转录，使MG细胞重新回到去分化增殖状态。同时，在Lin28缺失的情况下，即使上调了Wnt/β-catenin通路，MG细胞的增殖也变得非常有限。因此，在哺乳动物中，Wnt/β-catenin-Lin28-let7 miRNA的信号通路在调控MG细胞的去分化增殖方面发挥了关键的作用[19]。Yao等[1]采用转基因技术，在一种先天性光感受器受损的Gnat1rd17Gnat2cpfl3双突变小鼠模型中，通过玻璃体腔内注射ShH10-GFAP-β-catenin激活Wnt通路，2周后再转入Otx2、Crx和Nrl等3个基因诱导MG细胞的分化，4周后发现，标记的MG细胞分化成为了视杆细胞，这些MG来源的视杆细胞，从形态上与原来的视杆细胞相类似，并且使这种先天失明小鼠模型的视觉冲动得到了恢复。该研究进一步明确了哺乳动物视网膜细胞在Wnt信号作用下的确可以被重新激活，分化为有功能的光感受器，从而实现哺乳动物视网膜的修复功能。

视网膜的干细胞来源

睫状边缘带/色素睫状缘来源的干细胞在低等脊椎动物中，如鱼类和两栖类动物，视网膜修复的干细胞来源于其周边睫状边缘带(ciliary marginal zone，CMZ)的色素细胞。CMZ的色素细胞在性质上与RSCs相类似，可以产生视网膜所有的神经细胞和胶质细胞[20]。孵育的小鸡眼中也存在CMZ细胞，但其活跃度远不及鱼类和两栖类动物[21]。哺乳动物中不存在CMZ的组织结构，取而代之的是进化后的色素睫状缘(pigmented ciliary margin，PCM)，其组织结构上与CMZ类似，人们曾一度认为哺乳动物的PCM也能像鱼类一样，能修复损伤的视网膜，但最终发现，哺乳动物中所谓PCM来源的RSCs实际上只是普通的色素上皮细胞，尽管它们在加入生长因子时能表达神经干细胞的标志物，但无论在体外或体内实验中，它们都无法分化成为视网膜神经元。为此，哺乳动物PCM来源的细胞是否能成为视网膜再生的干细胞来源还有待进一步探索[22]。

RPE来源的干细胞RPE细胞是低等脊椎动物中内源性视网膜再生的重要细胞来源，此类动物的视网膜被损伤或完全切除后，可由来自RPE的细胞进行修复，这种现象被称为转分化[23- 24]。Spence等[25]研究发现，鸡类的神经视网膜中也存在类似的转分化现象，在孵育3～4 d的鸡胚中切除神经视网膜后，部分RPE细胞去分化成视网膜祖细胞(retinal progenitor cells，RPCs)，并进一步增殖分化成为新的视网膜神经细胞。鸡胚中RPE细胞的去分化过程与两栖类动物非常类似，然而鸡胚中RPE细胞无法在视网膜损伤后自我去分化，需要添加成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)和配对盒蛋白6(paired box protein 6，Pax6)进行诱导才能实现转分化过程。哺乳动物的RPE细胞在一定条件干预下，也可以发生类似的转分化过程，这种转分化后的细胞被称为RPE转化的多能干细胞(RPE stem cell，RPESC)，RPESC在体外表现出很强的自我增殖及分化能力，但其能否作为一种新的视网膜修复的细胞来源尚待进一步体内实验证实[26- 28]。

MG细胞来源的干细胞MG细胞与视网膜其他神经细胞有着共同的干细胞来源，在鱼类及两栖类中，MG细胞始终充当着胶质细胞和RSCs的双重角色。正常情况下，MG细胞处于分裂的静止期，视网膜损伤后，他们重新进入细胞分裂期并去分化成为RSCs，进而对视网膜进行修复[29- 30]。与鱼类和两栖类相比，哺乳动物的MG细胞在视网膜损伤后并不能自发的去分化增殖而修复视网膜，但在添加维甲酸或强制性表达Math3、NeuroD1和Pax6等基因后，MG细胞便具备去分化增殖的能力而成为RSCs，同时，其去分化的效率也会得到很大提升[31]。此外，作为神经干细胞关键转录因子之一的Sox2也参与了MG干细胞潜能激活的过程。在光损伤的视网膜中，MG细胞的Sox2表达显著增加，其表达水平与MG细胞的去分化增殖呈正相关，因此，Sox2也可能是激活MG干细胞潜能的必要因素之一[12]。

最新研究发现，前神经转录因子Ascl1与转录因子Lin28是哺乳动物MG细胞进入重编程程序的关键因子[12，32]。Ueki等[33]研究发现，在未损伤的小鼠视网膜中，MG细胞Ascl1的表达并不明显，当视网膜受损时，MG细胞中Ascl1的表达明显增加并产生类似于斑马鱼视网膜再生早期时的反应。Jorstad等[4]采用具有神经毒性的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)制作视网膜损伤模型，同时使MG细胞特异性过表达Ascl1，再加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理后，结果发现MG细胞开始朝视网膜神经元分化，与损伤的视网膜建立了新的神经元突触联系，这种新的突触联系对光照能产生神经冲动，而且通过示踪技术标记细胞发现，再生的神经元均来自于增殖的MG细胞。除了Ascl1与Lin28之外，α7烟碱乙酰胆碱受体激动剂(α7 nicotinic acetylcholine receptor agonist，α7nAChR)也是哺乳动物MG细胞激活的重要因素之一。Webster等[16]使用含有α7nAChR的滴眼液PNU- 282987处理成年大鼠，结果发现在没有视网膜损伤及外源性生长因子加入的情况下，实验大鼠视网膜中出现了多种类型的视网膜细胞和神经元的自我增殖，而且这种视网膜细胞和神经元的增殖与PNU- 282987的给药剂量呈现出剂量依赖的方式。通过BrdU标记后发现，这些增殖的视网膜细胞和神经元均来自于活化后的MG细胞，且分化后可自行迁移至光感受器层和神经节细胞层，与其他细胞建立新的突触连接。该研究印证了成年哺乳动物视网膜中存在着内源性的神经元再生的假设。由此可见，在特定条件下，哺乳动物视网膜中的MG细胞可以作为视网膜损伤修复的干细胞来源。

结语及展望

调控干细胞增殖和分化的信号通路是一个非常复杂而且庞大的系统，现已证实，在哺乳动物视网膜中，MG细胞可以在视网膜损伤后通过上调Wnt信号通路而重新进入去分化增殖状态。除了MG细胞以外，视网膜内是否还存在着更多的干细胞来源，Wnt信号通路的各种受体、配体及调节子如何发挥作用等问题仍需要进一步探索。明确这些干细胞的信号调控方式，就能在视网膜损伤时，使这些沉寂的RSCs重新被激活，从而给视网膜病变的干细胞治疗带来新的曙光。