膝骨性关节炎动物模型选择与制备的比较

吴 强，郑倩华，蒋一璐，任润媛，李 瑛

(1. 成都中医药大学针灸推拿学院，成都 610075；2. 成都中医药大学基础医学院，成都 610075； 3. 成都中医药大学研究生院，成都 610075)

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)又称退行性关节炎、增生性关节炎，多在中年以后发病，好发于负重大、活动多的关节，如膝、髋、脊柱等处[1]。其基本的病理改变为软骨破坏、软骨下骨硬化及骨赘形成。在临床上求诊的OA患者中，以膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)最为多见，症状多以膝关节疼痛、僵硬、活动时的骨摩擦音及膝关节肿胀变形为主，治愈困难，晚期有致残风险。研究KOA的发病机制、治疗方法及起效机制是预防和治疗KOA的重要内容，KOA动物模型是研究KOA的重要手段，笔者通过查阅文献，结合笔者对KOA动物模型的研究经历，探讨比较各类KOA动物模型的优缺点，以期对实验性KOA动物模型的选择与制备提供有效参考。

1 动物与制备方法的选择

1.1 动物选择

动物是KOA模型的客观载体，合理选择动物对KOA模型的成功制备及保证后续实验的顺利开展具有重要意义。因此，选择恰当的动物制备KOA模型是研究者首要考虑的问题。动物的选择应考虑以下两个层面：一是动物种属的选择；二是动物雌雄的选择。动物种属决定所选动物的发病机制、基因与人类发病机制、基因的相似性，以及动物对施加处理因素的敏感性、特异性和动物模型的稳定性、经济性等因素[2]；动物雌雄差异亦会对OA产生影响，如雌性动物的雌激素、卵巢状态会影响到骨代谢，因此，除特殊研究需要(如研究雌激素对OA的影响等)外，以选择雄性动物居多。

据文献报道，目前KOA模型常用的动物载体有家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、犬、马、羊、猪等。每种动物KOA模型都具有各自特点和适用范畴：(1)家兔性格温顺，繁殖能力好，抗病能力强，体型适中，易于饲养和抓捕，易于给药。且家兔下肢相对较大，便于多种方法的模型制备及进行关节内操作，是KOA动物模型的理想载体，应用率较高；但家兔自愈能力较强，且其抗体、细胞因子等较难获得，因此在KOA发病进程研究、分子生物学研究、细胞生物学研究等方面应用不够理想。(2)小鼠生长期短、成熟快、繁殖力极强，性情温顺，价格低廉，饲养与管理方便，易于抓持和灌胃等操作，且其对外界刺激极为敏感。基因组测序表明小鼠与人类平均85%的基因序列高度一致[3]，故多用于与遗传相关的KOA发病机制的研究，但小鼠体型较小，下肢关节较细，不易于关节局部及关节内的操作，且小鼠关节软骨、滑膜组织量少，不利于观察研究。(3)大鼠与小鼠相似，生存与繁殖能力强，造模周期短，体型相对较大，模型反应灵敏，多应用于症状观察(如疼痛表现)和药物研究，亦多用于细胞生物学、组织工程学及KOA与神经系统相关性的研究。(4)豚鼠在研究KOA方面应用较少，多以自发性KOA建立模型，自发的豚鼠KOA模型与人KOA在发生机制和组织病理学上相似度极高，多用于研究KOA的生物标记测定以及组织水平检测。(5)犬、马、羊、猪等大型哺乳动物在软骨厚度、病变进程及软骨损伤恢复等方面与人类更为接近，且其关节较大，易于手术等关节内操作，但大型哺乳动物饲养困难，成本高昂，且造模难度大，不易于同时获得较多样本。

1.2 制备方法

KOA动物模型的制备方法可以分为三大类：一是自发性动物模型，即不予实验动物任何人为干预，在自然状态下等待动物发生KOA，如C57BL/6小鼠、豚鼠等。自发性KOA模型与人在自然状态下形成的KOA，在发病机制、病理表现和防治效果等方面最为相似，缺点是造模周期长，饲养成本较高，不易同时获得大量实验模型；二是诱发性动物模型，此法最为常用，包括物理诱发(如关节制动、负重运动)、药物诱发(关节腔药物注射)、手术诱发等实现方法，易于操作，易于控制模型的病理进程，能同时获得大量实验模型，且获得模型较为稳定；三是基因调控模型，即通过转基因技术对影响软骨细胞生成和凋亡的相关基因进行敲出，或导入外源基因，导致实验动物软骨发育不全或软骨细胞过度凋亡而发生KOA，此法获得模型稳定，可降低操作误差的影响，且排除了手术创伤出血及炎症对滑膜、软骨生化代谢的影响；缺点是费用高昂，且其病理改变是由基因缺陷引起，能否完全模拟人KOA的发病机制仍然值得商榷。

此三种方法在造模周期、操作难度、模型稳定及研究偏重、实验经费等各方面差异较大，优缺点并存，应用时应灵活选择。

2 动物模型制备

2.1 兔KOA模型的制备

2.1.1 兔制动诱导模型

兔制动模型是以石膏绷带约5～6层固定兔后肢于过伸位、中间位或过屈位，一般固定4～6周可出现早中期KOA的病理表现，6～8周可出现中晚期KOA的病理表现。如曾俊华等[4]采用管型石膏过伸位固定兔膝关节4周、6周、8周后，发现兔膝关节出现不同程度关节囊变性、关节间隙变窄、软骨破坏及滑膜炎症改变、骨赘形成等，成功复制出早期、中期、晚期KOA模型。尚平等[5]将6月龄新西兰兔分成2组，分别行过伸位固定和过屈位固定，7周后、13周后分别取材验证，发现两组在两个时间段的肉眼解剖学观察、软骨病理学评分、软骨细胞凋亡指数等指标上均符合KOA的病变特点，且两者差异无显著性(P>0.05)，并认为过曲位固定法在操作简便性、家兔适应性、成功率等方面优于过伸位。

2.1.2 兔药物诱导模型

兔膝关节腔药物诱导可选木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶等药物。先将兔麻醉，清理膝关节附近的毛发，严格无菌操作，将兔下肢屈曲，于髌韧带外侧凹陷处垂直进针，出现落空感后回抽无血或关节液，再将一定浓度的药物注射入关节腔。一般末次注射2周后即可出现KOA样改变。如陈达等[6]将0.5 mL 6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液注入兔膝关节腔，4周后取材观察，见滑膜增生，软骨变薄、粗糙，镜下见软骨细胞数量减少、排列紊乱，局部见基质染色变浅及多重潮线等，符合KOA软骨病变特点。Hermeto等[7]将2.0 mg的Ⅱ型胶原酶溶于0.5 mL无菌磷酸盐溶液(sterile PBS)，在实验的第1天和第4天两次注射进兔膝关节腔，14周后动物实施安乐死，观察股骨内外髁发现软骨侵蚀、缺损明显，病理切片染色后显示软骨下骨以上全层软骨缺损，裂隙形成及软骨表面不规则等，提示KOA存在。

2.1.3 兔手术诱导模型

Hulth法[8]是经典的手术造模法，方法是阻断内侧副韧带、切除内侧半月板，并同时切断前后交叉韧带，此法能得到稳定的KOA模型。熊元等[9]采用改良Hulth法复制兔KOA模型，方法是先将兔麻醉，取膝关节内侧入路，切开后将髌骨外侧脱位，屈曲下肢暴露并切断前交叉韧带，同时切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，髌骨复位后缝合，术后7 d青霉素抗感染。8周后获得典型的兔KOA模型。此法较Hulth法操作简单，创伤较小，且能保持膝关节部分稳定性，较符合人KOA的临床实际。Roman-Blas等[10]对实验兔实施前交叉韧带横断造模(ACLT法)，并与关节腔注射胶原酶比较，造模6周后两组均出现软骨缺损等典型KOA样表现。

此外，除单纯手术法外，还可联合负重法[11]、强迫运动法[12-13]等制作KOA模型。如李炳辉等[11]应用Hulth法对家兔造模后，每天将其前肢捆缚，使其直立2 h，形成后肢负重模型，结果发现联合负重能使家兔更早出现中期KOA软骨缺损表现。张冲等[13]采用改良Hulth法联合强迫奔跑法(约每日2 h/800 m)造模，2周后出现软骨改变，10周后出现典型的晚期OA样改变，13周后获得典型的KOA模型。手术联合负重法或强迫运动法制作KOA模型可加快关节退变，缩短造模周期。

2.2 大鼠KOA模型的制备

2.2.1 大鼠制动诱导模型

大鼠制动模型多采用伸直位石膏固定法，将大鼠膝关节伸直180°位，在踝关节至髋关节之间用医用棉垫衬后，石膏绷带固定5～6层，一般固定4周、6周、8周时可分别获得早期、中期、晚期KOA模型。如钱洁等[14]研究大鼠石膏制动模型与ACLT模型时发现，两者均能成功复制大鼠KOA模型，但ACLT模型在实验6周、8周分别表现为早期和中期OA，且其首动因素是软骨基质流失；石膏制动模型在实验3周、6周和8周分别出现早期、中期和晚期OA表现，较ACLT模型出现病变时间早，且其病理特点是软骨细胞损伤和基质分解。

2.2.2 大鼠药物诱导模型

大鼠药物诱导模型常使用碘乙酸钠(MIA)、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶等。将大鼠麻醉备皮，消毒铺巾，大鼠下肢屈曲，于髌韧带外侧凹陷处进针，针管稍向外侧倾斜，出现落空感后将一定浓度的药物注射入关节腔。如Kellyy等[15]用碘乙酸钠(1 mg，50 μL)成功诱导大鼠KOA模型。汪宗保等[16]用0.15 mL 2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L左旋半胱氨酸的2∶1 混合溶液，在第1、4天分别两次注射进大鼠膝关节腔，结果发现4～6周后诱导出早期KOA模型。黄永明等[17]在第1天和第4天给予大鼠膝关节腔注射0.02 mg/50 μL Ⅱ型胶原蛋白酶，7 d后观察,大鼠体重下降，关节直径增大，组织形态学显示滑膜充血、纤维素覆盖及炎细胞浸润的早期OA的表现。

2.2.3 大鼠手术诱导模型

大鼠关节手术诱导KOA模型的方法有与家兔类似，有Hulth法、改良Hulth法、ACLT法、内侧半月板横断法(MMT)等。如Giuliana等[18]采用MMT法建立大鼠KOA模型，术后1周、3周分别取胫骨平台软骨(内外侧、内侧骨赘区)和滑膜(内外侧)不同部位采集组织，分别用于组织学和基因表达检测，结果发现手术对外侧组织基因表达没有影响，但对胫骨平台内侧基因表达有影响，且与对照组和假手术组相比，MMT组中14种基因的表达显著不同。该实验检测多个局部组织基因表达为评价潜在治疗药物对OA疾病进展的作用提供了良好范本。李安琪等[19]采用髌韧带部分切损联合内侧副韧带横断法诱导大鼠KOA模型，术后3周和6周分别得到早期和晚期KOA模型。此外，Pernille等[20]使用关节外手术的方法研究雌性大鼠卵巢切除对软骨的影响，结果术后9 W成功得到绝经后OA的实验模型。此法对研究雌激素和雌激素样物质对软骨保护作用提供了有用的实验模型。

2.3 小鼠KOA模型的制备

2.3.1 小鼠手术诱导模型

小鼠手术模型多以切除或部分切除内侧半月板为主，如谢靖等[21]用改造的胰岛素注射针头雄性C57小鼠实施半月板切断造模取得成功。方法是膝内侧入路，暴露出内侧半月板外缘，用改造弯曲的胰岛素注射针头钩出半月板并剪断，缝合切口。术后1周，胫骨平台软骨出现区域性磨损和胞外基质蛋白多糖减少；6周、12周后软骨磨损范围逐渐增大，至软骨下骨暴露；软骨胞外基质蛋白多糖的减少逐渐加剧。此法创面小、操作简单，能诱导出可靠的小鼠KOA模型。

2.3.2 小鼠药物诱导模型

对小鼠采用关节腔内药物诱导KOA模型的文献报道不多，其药物选择、操作方法与大鼠类似。常用药物为木瓜蛋白酶、碘乙酸盐和胶原酶。如Kraan等[22]分别用木瓜蛋白酶、碘乙酸盐和胶原酶给予C57小鼠膝关节腔内单次注射后，小鼠膝关节局部出现基质减少、软骨细胞增殖和骨赘形成的KOA病理改变。并发现胶原酶是通过破坏韧带、肌腱等使关节不稳而诱发KOA；木瓜蛋白酶或碘乙酸盐是直接干扰软骨代谢诱发KOA。

2.3.3 小鼠基因调控模型

基因调控诱导KOA模型多以小鼠为研究对象。如Arita等[23]将突变的人Col2a1两个等位基因导入小鼠基因序列，得到转基因小鼠较正常小鼠身材小，软骨生长板紊乱且有腭裂，电镜示软骨II型胶原纤维密度降低、软骨细胞的高尔基体扩张，显示出早发性全身性OA和软骨发育不全的特征。曹斌等[24]对OA转基因动物模型的文献研究发现，敲除小鼠Col11a1基因、敲除Col2a1基因、Del1基因突变、Ⅱ型胶原基因突变、Ⅸ型胶原基因突变、软骨基质基因缺陷等都可能导致小鼠OA的发生。

2.3.4 小鼠肥胖诱导模型

肥胖是OA的危险因素，研究发现小鼠高脂饮食引起的肥胖，可引起OA及全身低度炎症的发生[25]，增加小鼠创伤性OA的严重程度[26]。Asou等[27]研究增加的机械负荷在肥胖诱导OA发作中的作用时发现，高脂饮食能增加小鼠软骨细胞凋亡和骨赘形成，但此过程并不完全由于肥胖造成的关节负荷增加，而是机械负荷依赖和独立机制共同作用的结果。

2.4 豚鼠自发性KOA模型

豚鼠KOA模型也可以通过手术、关节腔注射等方法诱导，但文献报道以自发性豚鼠KOA模型为多。如马驯[28]将42只Hartley豚鼠在自然喂养状态下，分别在1、2、3、4、6、9、12月龄时进行膝关节标本的观察和检测，结果显示：组织学及改良Mankin评分在1、2月龄时，关节表面软骨结构、软骨细胞数量和软骨基质均正常，3月龄时开始出现OA样改变，并随着月龄的增加，软骨退变逐渐加重，到12月龄时出现了中度OA的软骨表现；Micro-CT扫描提示，软骨下松质骨由小月龄开始出现逐渐疏松化，在4～6个月龄时转向逐渐硬化，且软骨下骨板随着月龄的增加逐渐增厚、硬化。

2.5 犬KOA模型的制备

犬类KOA模型的制备多以手术和药物诱导为主，手术诱导可用Hulth法、改良Hulth法、ACLT法、关节刻痕法[29]；药物多采用木瓜蛋白酶。如罗春海等[30]用ACLT法诱导犬KOA，术后4周、8周、12周进行组织学检测与高频超声检查，结果显示：随着造模时间的延长，模型犬膝关节组织学检测同超声图像观察结果均呈进行性加重表现，关节积液增多、滑膜组织增厚、内外髁软骨变薄，可见高频超声对急性期及早期OA病变敏感，可用于诊断早期OA。

彭诗等[31]对中华田园犬进行药物诱导KOA，在第1、4、7天分别三次在犬膝关节腔注射0.5 mL 4%体积的木瓜蛋白酶溶液。结果模型犬出现静立时三肢站立，患肢不敢负重；行走时跳跃步态，患肢不敢蹬地，与KOA的临床表现吻合；组织病理学显示，滑膜壁血管明显增生，淋巴细胞浸润较多。

3 小结

骨关节炎(OA)不但给患者带来巨大痛苦和长久折磨，也给患者家庭和社会造成沉重的经济负担。据报道，我国KOA的发生率已达18%[32]，因此研究KOA的发生、发展、转归及防治措施等，成为医务工作者面临的重要课题。KOA动物模型为此类研究提供了良好的载体。目前复制KOA动物模型最常用的动物为家兔和大鼠，最常用的造模方法为石膏制动法、Hulth法和关节腔药物注射，不同动物、不同造模方法所建立的KOA模型各具特点。

制动模型是通过石膏、外固定支架等长时间限制关节的活动，使肌肉、韧带、关节囊挛缩，关节面压力增大，久而导致关节软骨损害。此法无创伤，其病理改变缓慢，更接近人KOA的病变过程，避免了手术造模引起创伤性关节炎和滑膜炎的干扰。更适合于药物筛选、药物疗效及局部分子、炎症递质等方面的研究。石膏制动法较适于兔、大鼠等动物，且有中间位、伸直位、屈曲位固定的不同。伸直位法较为常用，当动物肢体处于伸直位时，其肌肉、韧带、关节囊等受到牵拉，应力增大导致关节面压力增加，能进一步促进软骨的退变。有研究者认为屈曲位固定法在操作简便性、成功率等方面优于过伸位固定法，笔者实践后发现，受限于动物后肢的形态结构，屈曲位时石膏往往难以可靠固定，极易脱落。且笔者发现，在上石膏绷带时，不对肢体进行剃毛处理，使患肢动物毛发粘附于石膏绷带，能够有效防止石膏脱落，且毛发垫于皮肤与绷带间，可免于皮肤与绷带的直接摩擦，减少皮损的发生。应用石膏制动时，应注意，既要避免绑缚过松，使绷带易于脱落；又要避免绑缚过紧，造成肢体远端缺血肿胀，甚至坏死，并应做好防啃咬措施。

手术诱导法模型稳定，成功率较高，且造模时间短，病变时期易于控制。可分为关节内诱导和关节外诱导。关节内诱导通过破坏内侧副韧带、内侧半月板、前后交叉韧带、髌韧带等一种或多种组织，从而破坏膝关节结构，造成关节生物力学紊乱，关节失稳日久而诱发KOA。关节外诱导OA包括关节撞击[33]、卵巢切除[34]、跟腱离断[35]、股静脉或臀下静脉结扎[36-37]等，较适用于OA早期病理改变的观察和药物的筛选。应当指出的是，作为关节内诱导的软骨刻痕法，不进行永久性关节稳定性破坏而诱导KOA，将使KOA模型对各种治疗方式的反应更加敏感。手术诱导能较好的模拟创伤后OA，适用于外科或显微外科方面的研究，但此法需要严格无菌环境，对操作要求较高，术后需要抗生素处理。手术引起的创伤出血和炎症，干扰了滑膜、软骨的生化代谢，因此不宜应用于OA生化代谢类的研究。

关节腔内注射药物的造模方法，操作简便，易于大量造模。且得到的模型相对稳定，软骨破坏明显，较宜于组织形态学、行为学的观察，亦可用于药物防治方面的研究。常用注射药物有：化学类，如碘乙酸盐、秋水仙碱、甲醛等；酶类，如木瓜蛋白酶[38]、胶原蛋白酶、尿激酶[39]等；激素类，如肾上腺皮质激素、催产素等，亦有注射菲律宾菌素、肿瘤坏死因子[40]或白陶土、软骨碎片等异物诱发KOA模型者[41]。应该指出的是，不同动物应选择其适宜的药物及浓度进行注射造模，如笔者在用MIA(5 mg/mL，0.3 mL)对新西兰兔进行关节腔注射造模时，部分动物出现膝关节软骨下骨坏死的病理改变，值得注意。

自发性模型较少采用，可用于发病机制、症状观察、病理表现和防治效果等方面的研究。基因手段的发展为骨关炎模型的研究提供了新的思路和前景。目前基因诱导模型多以基因缺陷小鼠为主，可用于研究OA的致病基因、发病机制、软骨生化改变等的研究，也可用于测试某个基因片段对OA病变软骨的防止、延缓和逆转的研究[42]，并为研究基因手段预防和治疗OA提供美好前景。

总之，建立理想的疾病模型是实验研究KOA的重要基础，也是研究结果可靠性的重要保证。虽然复制KOA动物模型的方法多种多样，既可以选择不同种属动物，又可以对某一种属动物采用前述方法的一种或多种方法联合诱发，但是仍然没有一种模型能够完全模拟人KOA的发病机制、病例特点和临床表现等。不同动物用不同方法诱导的OA各有特点，实际应用时应根据研究目的、实验特点和实验条件等合理选择。