登革热动物模型研究进展

陈 倩，鲍琳琳，王 卫

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室，卫健委人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

理想的登革病毒感染动物模型是登革热防治研究的基础平台之一。研究表明，登革病毒可感染部分实验动物，如实验小鼠和恒河猴等，但要建立动物模型，均存在一些缺陷。例如，登革病毒可感染免疫缺陷小鼠，出现部分重症登革热的临床症状，如出血热、血管渗漏等，但需进一步验证免疫反应的产生情况[1-3]。登革病毒可在非人灵长类动物(non-human primates, NHP)体内有效复制，并诱发强烈的免疫反应，但不出现明显的临床表现。因此，了解每种登革病毒感染动物模型的优、缺点，扬长避短，努力开展登革热动物模型研究，才能有效支持登革热发病机理、抗病毒药物和疫苗的临床前评价等研究。本文通过介绍登革病毒感染动物模型的最新进展，阐明其制备方法和研究意义，为今后登革病毒感染疾病的预防与控制研究提供基础信息。

1 登革热动物模型研究进展

1.1 小鼠模型

为建立登革病毒感染模型，进行登革热发病机制研究及防治策略评价，科研人员最初使用登革病毒感染免疫健全小鼠。基于干扰素(IFN)对登革病毒复制的影响，又相继使用了IFN受体敲除小鼠、I-IFN受体敲除小鼠、条件性I-IFN受体敲除小鼠、及人源化小鼠等。由于动物的免疫系统不尽相同，其临床表现也不同，具体如下。

1.1.1 免疫健全小鼠模型

研究表明，登革病毒可感染野生型小鼠，即免疫健全小鼠，如A/J、BALB/c、C57BL/6等品系，虽然只出现暂时的病毒复制[2]。有报道指出，DENV-2病毒感染A/J小鼠后第2天，动物出现轻微的病毒血症，能通过RT-PCR方法检测出来[4]。DENV-2病毒感染C57BL/6小鼠，外周血液中病毒含量呈峰状，感染后第1天病毒含量增加，第3天达到高峰，第5天呈下降趋势。与其他受到感染的动物相比，DENV-2病毒感染BALB/c小鼠后，其血液中病毒滴度相对较低，很难检测出来[5]。因此，登革病毒在不同品系小鼠内的复制水平不尽相同。此外，小鼠的日龄也会影响登革病毒的感染和复制，登革病毒颅内接种野生型乳鼠，可表现出外周病毒血症[6]。因此，登革病毒感染免疫健全小鼠只能建立感染模型，无法建立致病模型。

1.1.2 AG129小鼠模型

鉴于干扰素(IFN)在抗病毒中的作用，推测IFN可抑制登革病毒感染。为此，研究者利用缺乏IFNɑ/β、IFNγ受体的AG129小鼠构建了登革病毒感染模型。登革病毒感染AG129小鼠后，病毒复制水平较高，不仅出现病毒血症、血小板减少和血浆渗漏等典型重症登革热的临床症状，还会产生细胞因子风暴引起的免疫病理反应等，因而成为登革病毒感染模型的常用动物。此外，为进一步完善该模型，科研人员还使用登革病毒在小鼠体内进行代及适应，分别建立了DENV1-DENV4感染AG129小鼠模型。如Gregg N. Milligan等建立的DENV-2感染AG129小鼠的致死模型。他使用一种在AG129小鼠体内可产生神经症状的DENV-2病毒株PL046，在蚊子细胞和AG129小鼠之间交替传代，模拟虫媒病毒的生命周期，产生的新病毒株命名为D2S10。该小鼠模型能很好地模拟登革热的临床表现，且不会产生神经症状。由于AG129小鼠微弱的固有免疫反应，登革病毒临床株(如S221和D2Y98P等)也能产生的很好的感染效果。其中以C0360/94(DENV-3病毒株)及703-4(DENV-4毒株)分别感染AG129小鼠，均会产生神经症状[7-9]。为明确不同血清型病毒对AG129小鼠的影响，Vanessa V. Sarathy在AG129小鼠及其他小鼠模型中对DENV-4(TVP-376)与DENV-2(D2S10)的易感性进行了比较。发现TVP-376病毒株感染小鼠会导致高病毒载量，然而，与D2S10和C0360/94不同，TVP-376病毒株感染小鼠不会引起血小板减少[10-13]。此后，又有报道描述了DENV-1非适应株(West Pacific 74)感染AG129小鼠模型，采用相同感染方法，可使小鼠致死。然而，West Pacific 74病毒株可使小鼠产生延迟致死性感染，且血管渗漏不明显，与其他模型具有差异[14]。

1.1.3 I型干扰素受体敲除小鼠

由于I型干扰素(I-IFN)对登革病毒复制产生主要影响，因而科研人员开始使用I型干扰素受体敲除小鼠用于登革病毒感染研究。Susana Orozco等使用105、106或107pfu D2S10及其衍生毒株D220，静脉接种6～8周龄的IFN-α/β受体敲除的C57BL/6小鼠，并观察至第14天，发现D220在IFN-α/β受体敲除小鼠中的致死率高于其亲代株。在非抗体依赖性增强的条件下，与之前使用D2S10病毒株感染缺乏IFN-α/β和γ受体的AG129小鼠的模型相比，使用低剂量感染免疫受损较低的IFN-α/β受体敲除小鼠，并产生登革热类似症状是一种改进[13]。

1.1.4 条件性敲除I型干扰素受体小鼠

缺乏I型和II型干扰素受体或仅缺乏I型IFN受体的小鼠对登革毒株易感，但感染模型的免疫系统严重受损，限制了该模型的广泛应用。Roland Züst等通过条件性敲除部分免疫细胞的I型IFN受体获得新的模型——条件性敲除I型干扰素受体小鼠，该小鼠具有免疫保护且对登革病毒敏感。如在CD11c+树突细胞和LysM+巨噬细胞上敲除IFNAR后，小鼠可被登革病毒感染并致死；而仅在CD11c+或LysM+细胞上敲除IFN受体后，小鼠易受感染，但感染一段时间后小鼠体内的病毒血症会被消除，从感染中完全恢复。与IFNAR-/-小鼠相比，条件性敲除IFNAR小鼠对登革病毒感染具有快速且强烈的CD8+T细胞反应。此外，在CD11c+或LysM+细胞上缺乏IFNAR的小鼠也具有足够的免疫活性，对DENV-2亚单位候选疫苗可以产生保护性免疫应答。这些数据表明，在登革病毒免疫研究和疫苗候选物筛选方面，条件性IFNAR表达缺陷的小鼠是一种改进模型[15-16]。

1.1.5 人源化小鼠模型

NOD/SCID等免疫缺陷小鼠缺乏T细胞、B细胞，且NK细胞功能缺陷、抗原呈递细胞发育和功能缺陷，溶血性补体缺乏，为人类造血细胞和组织的重建提供了良好的平台[17]。科研人员将登革病毒的靶细胞或其前体细胞注入免疫缺陷小鼠，构建人源化小鼠。该动物具有人的部分细胞，可以使小鼠更好地感染上登革病毒，并引发人类部分针对登革病毒的特异性免疫应答。Jaiswal等[18]表明，使用脐带血造血干细胞移植的NOD-scidIL2rγnull(NSG)小鼠支持登革病毒感染。来自HLA-A2转基因NSG小鼠的人T细胞在用登革病毒多肽刺激后可产生IFN-γ和TNF-α。这些小鼠还产生针对登革病毒包膜蛋白的IgM抗体[18]。使用DENV-2临床株感染人源化NSG小鼠(接种了人脐带血CD34+细胞)表现出登革热疾病的临床症状(如发热、病毒血症、红斑和血小板减少症等)[19]。研究还证明，登革病毒可感染人源化小鼠的骨髓、脾和血液中人的细胞，使其分泌有效的细胞因子和趋化因子[20]。

1.2 非人灵长类动物模型

登革病毒感染的自然宿主是人类和伊蚊。虽然非人灵长类动物感染登革病毒后不会产生典型的临床症状，但也会出现病毒血症及免疫反应，因此，NHP动物模型可用于研究感染病毒后的免疫反应，或评估候选疫苗[21]。目前，登革研究常用的NHP动物有恒河猴、食蟹猴和新世界猴等[3, 22]。

1.2.1 恒河猴模型(Rhesus macaques)

登革病毒感染恒河猴模型主要用于登革热疫苗的研发与评价。有研究表明，表达DENV-2的非结构蛋白NS5的登革病毒疫苗，在所有接种的恒河猴体内均诱导产生针对DENV-2的中和抗体，但所产生病毒血症的情况与预期结果不同，原因尚不清楚。这是在恒河猴模型中首次尝试使用重组疱疹病毒载体疫苗来预防登革热，并通过此模型来评价疫苗的免疫反应，在未来的实验中还可进一步探索新免疫原的效力和广度[23]。Stefan Fernandez等使用登革病毒感染恒河猴模型，评估了新的TDENV PIV疫苗候选物的免疫原性及其免疫保护作用。结果显示，具有明矾或佐剂系统的疫苗制剂具有良好的耐受性，在第二次免疫1个月后仍具有对四种血清型登革病毒强烈且持久的中和抗体应答[24]。

1.2.2 狨猴模型

Ananindeua等使用DENV-3感染黑羽狨((Callithrix penicillata)，测定其病毒载量、IgM和IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4等各种细胞因子及血细胞参数，从而进行其外周血标志物的动力学研究。对标志物的网络分析发现，在登革病毒感染早期，黑羽狨体内有两条主要路线具有保护作用，分别是：ɑ干扰素/淋巴细胞/血小板，以及病理性的IL-2/IL-6/病毒血症/单核细胞/凝血酶原(PT bond)[25]。Meng Ling Moi等在普通狨模型(Callithrix jacchus)中评估了二次异型登革病毒感染，先后使用两种血清型登革病毒感染狨猴，分析其继发感染后的病毒血症模式和抗体反应。结果表明：继发性感染后，狨猴的病毒血症和抗体反应与人类一致，并表明狨猴模型可用于研究登革病毒的原发性和继发性感染[26]。

1.2.3 东非狒狒模型(Olive baboon, Papio anubis)

Iris Valde’s等评估了非人灵长类动物东非狒狒(Papio anubis)作为登革热感染模型的可能性。使用103PFU和104PFU的2型登革病毒(DENV-2)分别感染东非狒狒和非洲绿猴，在两种动物体内都检测到较高水平的病毒血症，以及由中和抗体组成的体液免疫反应。虽然感染该病毒的狒狒体内阳性病毒的检出通常比非洲绿猴晚一天，但狒狒为DENV-2的实验性感染提供了另一种非人灵长类动物模型[3]。

2 动物模型的应用

2.1 发病机制中的应用

流行病学研究表明，不同血清型DENV导致的继发感染，会增加疾病(DF/DHF)的严重性[27]。为了解释这种流行病学观察，主要有两个假说：ADE和“T细胞抗原原罪(Original Antigenic Sin, OAS；亦称原始抗原过失)”。基于T细胞的“抗原原罪”假说表明，继发性登革病毒感染的增强主要由于非保护性交叉反应性T细胞的存在。有研究通过使用在IFN-α/βR-/-小鼠体内表达人CD8+T细胞表位而建立的的HLA*B0702转基因小鼠，比较了血清型特异性和交叉反应性T细胞在DENV感染后，对机体的保护与在发病机制中的作用。其结果提示，保护性CD8+T细胞对DENV感染具有保护作用。但交叉反应性T细胞在DHF/DSS发展的晚期可能具有促进发病的作用。这也说明，交叉反应性T细胞在大多数继发感染病例中是保护性的，但是一些未知因素导致其在DHF/DSS患者中将T细胞的功能从保护性转变为致病性[28-29]。

通过对登革病毒感染动物模型的研究，使用DENV1-4感染IFNɑ/β、IFNγ受体缺乏的AG129小鼠产生的致死性模型可以用来了解登革热的发病机制，但该模型的一个缺点是，在使用小鼠适应性毒株时，会产生神经症状，且即使在这些干扰素受体敲除小鼠中，大多数登革病毒分离株也不会诱导DHF样症状，只有一部分登革病毒分离株在此背景下提供致死性感染，说明病毒序列在动物模型建立中具有不同的组织嗜性。人源化小鼠模型的应用可使登革病毒体内感染人细胞，并引发人特异性免疫应答反应[30]。使用这些动物模型可以促进对登革热发病机制的理解与研究[31]。免疫健全小鼠模型表现出对登革病毒感染具有抗性，因为它们的先天免疫系统能够有效地清除全部病毒，但通过使用小鼠适应性毒株或不同的人工感染途径，例如颅内或腹腔注射，可增强毒株的致病力，使该模型能用于发病机制的研究及治疗药物和疫苗的测试[6, 32-33]。

2.2 疫苗研究中的应用

虽然非人灵长类动物模型(NHP)不会产生登革热的典型症状，但仍可用于研究病毒感染后的免疫反应以及评估候选疫苗。其中，东非狒狒在遗传和生理上与人类非常相似，在病毒血症期间能够提供足够的血液来测试评估登革热疫苗的参数，因而已广泛用于评价新型疫苗的有效性[3]。目前有研究使用恒河猴模型来评价减毒活疫苗候选物的抗体反应及保护作用，以及候选TDENV PIV疫苗制剂的免疫原性和保护效力，因此可用该模型进行疫苗的临床前研究[24]。

2.3 抗病毒药物测试中的应用

Natalia Frias-Staheli等证明，人源化小鼠易受登革病毒临床分离株感染，产生病毒特异性的适应性免疫应答，并对抗病毒药物治疗有反应。虽然需要对该模型进一步改进，但已证明，人源化BLT小鼠是研究登革病毒感染和发病机制及抗病毒药物和候选疫苗临床前测试的合适模型[34]。有研究表明，可使用骨髓细胞亚群Ifnar表达缺失的模型小鼠(LysM Cre+Ifnarf1/f1)筛选新的治疗性药物；该模型出现出包括血管渗漏，血液浓缩，血小板减少和肝损伤等病理表现，可以很好地再现部分人类感染登革病毒后的疾病症状，从而为药物的研发提供理论基础[35]。

3 讨论

随着登革病毒感染率和发病率不断上升，登革热的防治已迫在眉睫。虽然研究者们一直致力于探究登革热的感染机制，研发抗病毒药物与预防性疫苗，但一直没有很好的动物模型能够完全再现人类感染登革病毒后的临床症状及病理变化。现有登革病毒感染小鼠模型及非人灵长类动物模型表现出部分典型的病毒血症、抗体反应及临床与病理表现，可用于登革热致病机理、疫苗及抗病毒药物的测试与研究，但这些动物模型仍具有对病毒不敏感、病毒复制水平低、病理表现异化或临床表型不明确等缺点，还需要继续深入研究，推动动物模型不断成熟和完善，从而支撑登革热致病机制和多价疫苗的研究。