强直性脊柱炎实验动物模型研究进展

王志强，宫彩霞，李振彬

(1. 中国人民解放军联勤保障部队第九八医院，石家庄 050082； 2. 南京中医药大学第一临床医学院，南京 210023；3. 石家庄平安医院，石家庄 050012)

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种常见的免疫介导的慢性炎症性疾病，与人类白细胞抗原B27(human leukocyte antigen-B27，HLA-B27)密切关联，主要影响中轴骨骼和关节，也可出现葡萄膜炎、银屑病、炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)等关节外表现，同时心肺并发症风险增加[1]。在疾病进展过程中，AS特征性结构改变是导致患者早期严重残疾的主要原因。由于大多数患者发病年龄较年轻，AS的致残问题对社会经济学有重要影响。然而，AS的病因和发病机制尚未完全阐明[1]。

实验动物模型对于疾病机制和寻找新的治疗药物具有重要意义。由于AS病理过程的人体组织的获取较困难，因此实验动物模型的构建对AS研究尤为重要。国内外学者为构建能较好模拟人类AS疾病特征和病理过程的实验动物模型进行了不断的探索。AS的实验动物模型大致可分为HLA-B27转基因动物模型、炎症相关动物模型、强直性附着点炎动物模型和其他动物模型四类。本文就AS实验动物模型的建立和研究进展进行综述，以期为相关研究提供参考和借鉴。

1 HLA-B27转基因动物模型

HLA-B27是AS最主要的遗传危险因素，约90%的患者HLA-B27阳性，HLA-B27对AS的遗传效力为20.1%[1]。HLA-B27属Ⅰ类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)。通常情况下，经典的MHCⅠ类分子是由一个高度多态的重链、一个β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2 m)轻链和一个寡肽以非共价键结合组成的异三聚体。MHCⅠ类分子与抗原肽结合，并提呈给T细胞表面的T细胞受体(TCR)。HLA-B27在AS的发病机制主要有3个假说[1]，即①关节源性肽(arthritogenic peptide theory)假说：自身关节源性模拟肽被HLA-B27提成给CD8+T细胞，诱发细胞介导的免疫反应，从而导致AS；②未折叠蛋白反应(unfolded protein response)假说：HLA-B27在内质网中的错误折叠和累积，诱发应激反应，从而激活未折叠的蛋白反应，导致白介素23(interleukin-23，IL-23)的释放；③HLA-B27同二聚体模型(HLA-B27 homodimer model)假说：HLA-B27同源二聚体与自然杀伤(natural killers，NKs)和CD4+T细胞上表达的某些杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptors，KIRs)结合，导致IL-17的释放。这些假设均未能完全概括HLA-B27与AS的相关性。

1.1 HLA-B27/人β2 m(human β2 m，hβ2 m)双转基因大鼠模型

早在1990年，Hammer等[2]通过将含有HLA-B*2705(含一个6.5 kb的EcoRⅠ片段)和hβ2 m(含一个15 kb的Sall-Pvul片段)的DNA片段显微注射到大鼠受精卵内，建立HLA-B27/hβ2 m双转基因大鼠模型，并证实Lewis大鼠系的21-4H大鼠(HLA-B*2705∶150拷贝，hβ2 m：90拷贝)和F344大鼠系的33-3大鼠(HLA-B*2705：55拷贝，hβ2 m：66拷贝)更易感。该模型可发生与人类AS极为相似的脊柱炎和后爪关节炎，其他表现包括肠炎、银屑病样皮损、指(趾)甲角化过度和/或营养不良、脱毛、睾丸炎、心肌炎、轻度角膜炎和前葡萄膜炎等。此外，Tran等[3]用Lewis大鼠系的雄性(21-3 ×283-2)F1大鼠(HLA-B*2705：20拷贝，hβ2 m：50拷贝)建立了HLA-B27/hβ2 m双转基因大鼠模型。该模型分别在4～6个月龄、7～9个月龄发生关节炎(约70%)和脊柱炎(30%～50%)，所有F1大鼠均出现睾丸炎，但均无肠道炎症。但在发病前切除睾丸，可阻止关节炎和脊柱炎的发生[4]，提示睾丸炎与关节炎和脊柱炎存在一定的关联。值得注意的是，HLA-B27和hβ2 m转基因的拷贝数及其相对表达水平对AS表型有很大影响。高HLA-B27和hβ2 M拷贝数的33-3大鼠出现关节和关节外表现，而较低HLA-B27拷贝数的33-3大鼠仅雄性出现AS表型，较高HLA-B27拷贝数的33-3大鼠出现脊柱炎、增生性骶髂关节炎、指(趾)炎和侵蚀性周围关节炎，但无关节外表现[3]。此外，HLA-B27转基因大鼠发病对饲养环境的微生物状态有一定要求。无菌(germ free，GF)环境饲养的HLA-B27转基因大鼠并不出现关节炎和结肠炎[5]，而HLA-B27/hβ2 m双转基因大鼠在无特定病原体(specefic pathogen-free，SPF)环境中定植普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)可发生结肠炎[6]，提示AS发病取决于特定致病菌的致病作用。与野生型大鼠相比，HLA-B27/hβ2 m双转基因大鼠肠道微生物代谢产物和宿主代谢产物均发生改变，微生物代谢物丙酸治疗可减轻大鼠炎症[7]，提示遗传因素与环境因素的相互影响。最近，Ermoza等[8]研究发现，HLA-B27/hβ2 m双转基因大鼠脾、肠系膜淋巴结、结肠黏膜固有层CD4-树突状细胞数量减少，这种减少并不是由于其过度死亡所致，而是由于XCR1+树突状细胞亚群数量减少。Ermoza等[8]还发现，TLR-7刺激后XCR1+树突状细胞迁移(归巢)能力下降。基于XCR1+树突状细胞在维持肠道免疫稳态中起重要作用，Ermoza等[8]认为，XCR1+树突状细胞免疫耐受功能失调可能影响HLA-B27/hβ2 m双转基因大鼠自身免疫耐受的维持和炎症的控制。迄今为止，HLA-B27/hβ2 m双转基因大鼠是最受接受的AS动物模型之一，但该模型的缺点是造模周期长、技术要求高、步骤复杂、成模率低、临床表现差异大、价格昂贵，不适宜干预研究。

1.2 HLA-B27转基因小鼠模型

早在19世纪80年代，就有学者[9]对HLA-B27转基因小鼠AS模型进行了探索，但HLA-B27转基因小鼠并不发生炎性病变。直到1995年，Khare等[10]在β2 m缺陷小鼠中成功建立HLA-B27转基因模型。基于C57BL/10小鼠的遗传背景，将HLA-B27转基因小鼠中的HLA-B27阳性小鼠与(β2m-/-× HLA-B27)F1小鼠杂交获得HLA-B27+β2m-/-小鼠，但该模型在SPF环境下不发病，转移至普通环境下才开始发病。雄性小鼠发病率显著高于雌性小鼠。该模型小鼠病变多起于双侧后爪关节和邻近组织短暂的增殖性炎症，持续约2～3周，有纤维蛋白渗出和白细胞浸润及轻度骨侵蚀，其后是软骨细胞在关节附着点增殖、关节软骨融合骨化和骨赘形成，关节强直。这种强直主要影响关节边缘，而关节中央软骨在很长一段时间内保持完整，且脊柱不受累。因此HLA-B27转基因小鼠是否可作为AS模型尚有争议，并没有开展广泛的研究[11]。该模型有与HLA-B27转基因大鼠模型相似的缺点。

2 炎症相关动物模型

肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)是包括AS在内的多种炎性疾病发病过程中的重要细胞因子[12]。基于TNF的AS动物模型主要有TNF转基因小鼠和TNFΔARE小鼠模型。转入完整人TNF基因的Tg197小鼠模型不仅可自发性出现慢性多关节炎，还会出现伴有滑膜炎、骨侵蚀和软骨破坏的双侧侵蚀性骶髂炎[13]。这种TNF转基因小鼠病变不累及脊柱和椎间盘，也不会发生新骨形成导致的强直，因此不能完整模拟人类AS。但该模型特别适用于研究TNF介导的多关节炎，尤其是Wnt信号通路在成骨细胞形成中的作用[14]。转入小鼠跨膜TNF基因的TgA86小鼠模型可发生对称性慢性炎症性多关节炎，病理表现为血管翳形成、关节软骨和骨破坏，同时出现脊柱受累导致的尾部弯曲[15]，提示跨膜TNF在AS脊柱病变中的重要作用。mRNA稳定和翻译的调控机制是由mRNA序列上的特定元件驱动的。这些调控序列中的一大类由腺嘌呤-尿嘧啶多聚体以特征性AUUUA五核苷酸组成，因此被称为富含AU元件(AU-rich elements，ARE)。TNFΔARE小鼠模型是在129Sv × C57BL/6或CBA × C57BL/6小鼠混合遗传背景下，通过靶向敲除小鼠TNF基因的ARE元件建立的[16]。这种小鼠内源性TNF产生显著增加，表现为体重增长缓慢，死亡率增加，并于5～6周龄开始出现包括骶髂关节炎、脊柱炎、周围关节炎和附着点炎在内的慢性炎症性关节炎和克罗恩病样IBD[16-17]。

蛋白聚糖诱导的脊柱炎(proteoglycan-induced spondylitis，PGIS)小鼠模型是用人软骨蛋白聚糖免疫关节炎/脊柱炎易感的BALB/c小鼠和H-2 K单体型C3H小鼠构建[9]。这种小鼠模型早期出现外周关节炎，后期出现外周及脊柱关节的畸形、强直和功能受限，病理上表现为早期的滑膜炎、软骨侵蚀和后期的关节软骨细胞增殖导致的关节融合。该小鼠模型对研究AS自身免疫机制和易感基因有重要价值。已在(BALB/c × DBA/2)F2杂交小鼠中发现发现了两个与人类染色体特定区域同源的高度连锁的非MHC染色体位点：Pgis1和Pgis2[9]。PGIS小鼠模型具有操作简便、周期短、症状明显、成模率高等优点。

SKG小鼠是T细胞受体ζ链(T-cell receptor-ζ，TCRζ)相关蛋白(zeta-chain-associated protein，ZAP)70基因SH2区C端W163C突变(ZAP-70W163C)的BALB/c小鼠[18]。突变的ZAP-70与TCRζ不能正常结合，导致自身反应性CD4+T细胞逃离阴性选择(negative selection)，是引起自身免疫性关节炎的一个关键原因[19]。研究发现，酵母多糖[19]、凝胶多糖[20]、鼠衣原体[21]均可诱导SKG小鼠发生关节炎。经免疫后，几乎所有雌雄SKG小鼠均出现踝关节和腕关节的进行性关节炎，病理组织学显示，踝关节及关节外软组织水肿、炎症细胞浸润、滑膜炎和骨质侵蚀及足底筋膜炎、椎间盘炎、附着点炎、骶髂关节炎、指(趾)炎[19-21]。除关节病变外，小鼠模型还发生了银屑病样皮损、葡萄膜炎和IBD[20]。需要注意的是，小鼠饲养环境的菌群改变对发病有一定影响[22]。

IL-23/IL-17轴在AS发病机制中起关键作用。AS病理过程的启动依赖于IL-23[23]，且IL-23与附着点炎直接相关[24]。Sherlock等[24]用流体动力学方法将编码IL-23的微环DNA载体通过尾静脉导入雄性B10.RⅢ小鼠构建了持续IL-23高表达模型。这种模型出现四肢和中轴关节的附着点炎，病理表现为AS特征性骨合成和骨分解并存过程，即成骨细胞和软骨细胞活化增殖引起的骨膜上软骨、类骨质和新骨形成以及多核破骨细胞对骨皮质的侵蚀，认为附着点部位IL-23反应性维甲酸受体相关的孤儿核受体γt(responsive retinoic acid receptor-related orphan nuclear receptor γt，ROR-γt)+CD3+CD4-CD8-细胞与IL-23结合后，CD3+细胞大量分泌IL-17和IL-22，导致了附着点炎。除关节病变外，这种小鼠模型还出现了银屑病皮肤病理和主动脉根部炎症，但肠道、肝肾不受影响。此后，Reinhardt等[25]进一步证实，附着点部位与IL-23结合的CD3+细胞主要是γ/δ T细胞。此外，在HLA-B27转基因大鼠中发现由迁移树突细胞产生的幼稚CD4+T细胞产生IL-17增加[26]，而Th17细胞能促进产生IL-12 / IL-23的树突细胞的形成[27]，提示IL-23/IL-17是一个循环炎症通路，但IL-17的产生并非绝对依赖IL-23[28]。

A20蛋白是TNF-α诱导蛋白3(TNF-α-induced protein 3)基因产物，可通过抑制NF-κB的活化，强效抑制炎症反应，维持免疫稳态，树突状细胞(dendritic cells，DCs)的A20蛋白缺陷可导致多种炎症性疾病[29]。选择性DCs的A20蛋白缺陷小鼠除发生T细胞介导的IBD外，还会出现慢性血清阴性周围关节炎、附着点炎和脊柱炎[30]。

越来越多证据显示，肠道微生态在AS的发生发展中起重要作用[31]。基于内质网氨基肽酶1(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1，ERAP1)基因多态性与AS易感性相关，Pepelyayeva等[32]利用C57BL/6小鼠敲除ERAP1基因(ERAP1-/-)建立了AS模型。该ERAP1-/-小鼠模型不但出现自发性中轴关节强直、脊柱炎症和全身性骨质疏松，而且还出现了肠道菌群失调。Pepelyayeva等[32]还发现，由于ERAP1-/-小鼠Tr1样调节性T细胞(一种抑制性T细胞)和耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells，tDCs)数量减少，对抗原刺激表现出过度的固有和适应性免疫反应，使得免疫细胞进入脊柱关节而发病；ERAP1-/-小鼠自发产生了大量的特定肠道细菌种类。因此，ERAP1-/-小鼠是研究肠道菌群失调、骨骼和免疫系统相互作用的合适模型。

3 强直性附着点炎动物模型

DBA/1小鼠是国际公认的研究关节炎的实验动物模型。由于与人类AS有着显著的共同特征，DBA/1小鼠已成为AS最受研究的实验动物模型之一。成组圈养的雄性DBA/1小鼠从12周龄开始自发地出现关节炎[33]，到26周龄时，关节炎的发病率接近100%[34]。雄性DBA/1小鼠主要临床表现为伴关节肿胀和关节强直的不对称的指(趾)间关节炎(主要是后爪)、附着点炎和破坏性甲周炎，病理特点是短暂的急性关节炎后附着点细胞增殖、软骨内骨形成以及关节强直[34]，因此是研究AS炎症与病理性新骨形成联系的理想模型。需要注意的是，该模型的缺点是仅雄性小鼠发病，且其发病受环境因素影响较大[34]。

进行性强直(ank/ank)小鼠模型是一种常染色体ank单基因隐性遗传病小鼠，在临床表现、放射学和病理学上与人类AS相似[11]。该小鼠最初表现为四肢关节炎，随后出现严重的四肢关节和中轴关节的进行性强直。病理上先是多形核白细胞和巨噬细胞浸润，但主要是大量的羟基磷灰石钙结晶在细胞外基质内的沉积[11]，其关节强直过程可能是由于β-catenin信号通路的激活[35]。Krug等[36]将HLA-B27转基因小鼠与ank/ank小鼠杂交，观察其F1和F2代的表型，结果显示HLA-B27状态对小鼠进行性强直表型无影响。然而，Timms等[37]的研究显示，ank/ank小鼠的人类同源基因ANKH的遗传变异与人类AS的易感性和临床表现无相关性。

强直性附着点病(ankylosing enthesopathy，ANKENT)小鼠模型是由近交系C57BL/10小鼠获得[38]。具有C57BL/10遗传背景的C57BL/10.BR和其他H-2同品系的雄性小鼠可于3个月龄自发性出现踝关节和/或跗骨关节进行性强直，病理学上先是短暂的滑膜增殖和破坏性炎症，其后是附着点软骨细胞增殖、骨化，还可出现前葡萄膜炎[38]。这种小鼠模型需要注意的是：⑴单独笼养不发病，需分组笼养[39]，⑵无菌条件下不发病，需肠道内厌氧菌触发[40]，⑶8个月龄以上母鼠所生小鼠的患病率明显低于8个月龄以下母鼠所生小鼠[41]，⑷HLA-B27转基因小鼠发病率明显增高，但疾病严重程度相似，hβ2 m转基因对发病无影响[38]。

4 其他动物模型

MRL/MpJ-lpr/lpr(MRL/lpr)小鼠、BXSB小鼠和NZB小鼠均是研究自身免疫性疾病的常用动物模型。Oishi等[42]研究发现，雄性(MRL × DBA/1)F1小鼠和雄性(MRL × DBA/1)F2小鼠分别在(27.0±2.2)周、(19.5±3.9)周出现与雄性DBA/1小鼠相似的自发性强直性关节炎，关节组织病理学显示滑膜及邻近组织成纤维细胞增生，伴关节周围附着点的纤维性软骨细胞增生、骨化。Mori等[43]研究显示，所有雄性(MRL/RPL × C3H/LPR)F1小鼠、61.8%的雄性(MRL/RPL × C3H/LPR)F2小鼠自发性出现不可逆的踝关节强直，关节病理与Oishi等[42]的研究相似。此外，Abe等[44]研究发现，与自发性出现系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的雌性(BXSB × NZB)F1小鼠不同，雄性(BXSB × NZB)F1小鼠并不发生SLE，而在被成组圈养的条件下，在7个月龄时，83%的小鼠自发性发展为血清阴性AS，表现为后爪踝/跗骨关节的附着点炎，关节病理亦与Oishi等[42]的研究相似，而后爪其他关节、前爪和脊柱不受累。Mori[43]和Abe[44]的研究均显示亲代小鼠无论雌雄都不发病，提示这种疾病的发病，是由从亲代双方的易感基因相互作用控制的。杂交小鼠是研究AS附着点炎及相关疾病遗传、环境和分子机制的合适模型，但其较DBA/1小鼠的发病周期更长，价格更加昂贵，且更不易获得。

最近，Dibra等[45]通过C57BL/6背景的IL-27受体α(IL27 A)缺陷IL27RA-/-小鼠与C57BL/6和129/SvJ背景的P53R172H/+小鼠杂交获得携带p53杂合子(含有1个野生型p53基因拷贝和一个突变型p53基因拷贝)的IL27RA-/-P53R172H/+小鼠。这种小鼠在4个月龄时出现椎间盘软骨骨化，12～14个月龄时出现脊柱严重的骨丢失和病理性骨形成，但炎症反应轻微。同时该小鼠还发生了慢性肾病、慢性皮炎、尾椎的慢性骨膜炎和骨髓炎。这种小鼠模型的特点是：⑴骨丢失和软骨骨化严重而炎症反应轻微，提示炎症并不是骨丢失和软骨骨化的必要过程，⑵是研究骨丢失和软骨骨化机制及这两个过程是如何相互关联的理想模型，⑶可以从4个月龄开始动态监测骨丢失和软骨骨化病理过程中的具体变化[45]。

此外，AS动物模型在熊科、犬科及灵长类动物中也有研究[46]，但这些模型价格昂贵、饲养条件要求高、实验影响因素较多，因此研究很少，本文不做详细论述。

5 结语

综上所述，目前已构建出多种AS实验动物模型。针对AS疾病过程中的不同发病机制、临床表现和病理过程不同的动物模型研究，为我们提供了新的认识。例如，HLA-B27分子特征如何触发了AS的发病，炎症与新骨形成之间的关系，新骨形成过程中潜在的信号通路靶点，这显示出动物模型在AS研究中的巨大推动作用。然而，迄今为止尚无任何一种动物模型能完整模拟人类AS的临床表现和病理进展过程。基于实验动物的基础研究和临床研究的相互借鉴，对于我们深入了解AS及相关疾病的机制和开发新的治疗策略，具有十分深远的意义。