乳酸菌胞外多糖对逆境胁迫下水稻种子萌发及幼苗生长的影响

张文平 杨 臻 吴佩佳 李依扬 程 新 李昆太

(江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045)

近年来，随着现代农业生产强度的增加，以及农药化肥的大量使用，导致土壤生态环境急剧恶化，土壤酸化、盐渍化等问题日益严重[1-2]。据报道，我国土壤酸化的总面积高达2.04×108hm2，约占全国土壤面积的22.7%[3]；土壤盐渍土壤面积约达3 600万hm2，占全国可利用土地面积的4.88%[4]。土壤环境的不断恶化使农作物生产受到巨大威胁，特别是水稻等主要粮食作物受土壤环境变化的影响较大[5]。因此，如何提高水稻等作物的抗逆性已成为研究热点之一。研究表明，改良土壤[6]、平衡施肥[7]、生物诱导[8]等方式均对提高水稻抗逆性有较好的效果。目前，关于添加外源物质来提高作物的抗逆性的研究已有大量报道，其中微生物多糖在促进种子萌发、幼苗生长以及增强作物抗逆性等方面的调节作用越来越受到人们的关注[9]。微生物胞外多糖能够提高作物在不同逆境胁迫下的抗逆性已在高粱[10]、小麦[11]、烟草[12]等作物上得到证实，而其对水稻生长发育的影响研究尚鲜见报道。

水稻(Oryza sativa)种子萌发期的生长状况对水稻后期的生长发育及产量有着重要影响[13]，而通过添加微生物多糖来增强水稻对酸、盐等胁迫条件的抵抗能力，对提高水稻的生长和产量具有重要意义。因此，本研究以乳酸菌(Lactobacillus plantarum)胞外多糖为试验对象，研究其对酸、盐胁迫下水稻种子萌发的影响，并通过酶学测定等方法初步阐明胞外多糖诱导水稻抵御酸、盐胁迫条件的作用机制，以期为稳定和提高胁迫条件下水稻生长和产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，由江西农业大学微生物资源与利用实验室提供。

供试水稻品种:准两优608，由湖南隆平种业有限公司提供。种子用5%NaClO消毒10 min，然后用蒸馏水冲洗6次，备用。

改良MRS培养基:用蔗糖替代MRS培养基[14]中葡萄糖，其他成分保持与MRS培养基一致。

1.2 试验设计

1.2.1 胞外多糖的制备及含量测定 将活化的植物乳杆菌接种于改良的MRS培养基中，于37℃发酵24 h。参照Rimada等[15]的方法进行粗多糖提取，然后采用硫酸-苯酚法[16]测定胞外多糖含量。

葡萄糖标准曲线的绘制:取0～0.2 mg·mL-1不同浓度葡萄糖标准溶液各2 mL，加入2 mL 6%苯酚溶液，再加入浓硫酸10 mL，摇匀，冷却后利用UV759紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)于490 nm波长处测定吸光度，样品适当稀释后参照标准曲线方法进行胞外多糖含量的测定。

1.2.2 胁迫处理 酸、盐2个胁迫因子分别为pH值3.0的H2SO4溶液和7.0 mg·mL-1NaCl溶液。设胞外多糖处理浓度分别为 0、2、20、200、2 000 mg·L-1。 将消毒的水稻种子分别放入不同浓度的多糖溶液中，于室温下浸种24 h，然后用蒸馏水冲洗种子并晾干，将种子置于铺有两层无菌滤纸的培养皿(直径9 cm)中，每个培养皿30粒种子。按照上述条件分别进行酸、盐胁迫，然后将培养皿置于28℃培养箱中黑暗培养，以无胁迫处理作为对照(CK)，每个处理设3次重复。培养期间每日观察并记录种子发芽情况，定期更换培养液，以保证胁迫环境不变，培养至第8天时，测定水稻幼苗形态指标和生理指标。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 形态指标的测定 培养时期每天记录水稻种子萌发数量，第3天统计种子发芽势，第8天统计种子发芽率并测定水稻幼苗的根长、芽长、根鲜重和芽鲜重(根鲜重、芽鲜重按皿计算)。按照下列公式计算发芽势、发芽率及发芽指数:

式中，Gt:t日的发芽种子数；Dt:发芽天数。同时将经过以上处理的发芽的种子播种于塑料培养盒进行苗期生长，分别于第10和第20天测定形态指标。

1.3.2 生理指标的测定 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量:采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法[17]测定 MDA含量。先用蒸馏水，再用去离子水将水稻幼芽冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，称取0.2 g，加入10 mL 10%三氯乙酸和少量石英砂，在冰浴中研磨成匀浆，于4℃下4 000 r·min-1离心10 min，上清液即为提取液，用于MDA含量的测定。

抗氧化酶活性:称取0.5 g洗净的水稻幼芽，剪碎后置于预冷的研钵中，加入预冷的0.05 mol·L-1磷酸缓冲液5 mL(pH值7.8，2%聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，冰浴研磨成匀浆，4℃下 10 000 r·min-1离心 15 min，上清液即粗酶液，用 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液定容至10 mL，然后分别采用双氧水法测定过氧化氢酶(catalase，CAT)活性；愈创木酚法测定过氧化物酶(peroxidase，POD)活性；氮蓝四唑比色法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性[18]。

上述指标每个处理均设3个重复。

1.4 数据处理

采用Origin 8.5、DPS 7.5软件进行统计分析和差异显著性检验，对不同处理的数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较。

表中数据均为平均值±标准差。图、表中不同小写字母表示不同处理间在α=0.05水平上差异显著。

2 结果与分析

2.1 酸胁迫下胞外多糖对水稻种子萌发及生理特性的影响

2.1.1 酸胁迫下胞外多糖对水稻种子萌发的影响由表1可知，与CK相比，酸胁迫对水稻种子的发芽率、发芽势及发芽指数均有显著的抑制作用(P＜0.05)，而胞外多糖溶液浸种对酸胁迫下水稻种子的萌发具有促进作用。随着胞外多糖浓度的增加，种子的发芽势、发芽率及发芽指数均呈先增加后降低的趋势。其中20 mg·L-1胞外多糖对发芽势的促进作用最为明显，与酸胁迫下不添加胞外多糖相比，提高了186.9%，而与无胁迫处理(CK)相比，仅降低7.0%。200 mg·L-1胞外多糖处理的发芽率最高达到92.50%，发芽指数也为最大，与酸胁迫下不添加胞外多糖相比，发芽率提高了38.7%。当多糖浓度增加达到 2 000 mg·L-1时，对水稻种子萌发的促进作用略有降低，但仍具有显著改善胁迫的效果。

表1 不同浓度胞外多糖对酸胁迫下水稻种子萌发的影响Table1 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on the germination of rice seeds under acid stress

2.1.2 酸胁迫下胞外多糖对水稻种子根长、芽长及根鲜重、芽鲜重的影响 由图1可知，酸胁迫对水稻幼芽生长的抑制效果不显著，但对根系生长的抑制效果显著(P＜0.05)。与CK相比，酸胁迫下不添加多糖芽长与根长分别降低1.8%和70.2%，芽鲜重与根鲜重分别降低15.5%和74.4%。随着多胞外糖浓度的增加，其对水稻根系生长的促进作用增加。与CK相比，200 mg·L-1和2 000 mg·L-1胞外多糖处理的根长分别增长35.1%和59.6%，根鲜重分别增加79.5%和126.1%，且均显著高于CK。

图1 不同浓度胞外多糖对酸胁迫下水稻根长、芽长、根鲜重、芽鲜重的影响Fig.1 Effect of different concentration of exopolysaccharides on root length，shoot length，root fresh weight and fresh weight of rice under acid stress

2.1.3 酸胁迫下胞外多糖对水稻幼芽MDA含量及抗氧化酶活性的影响 由图2可知，酸胁迫对水稻MDA含量有显著的提高作用，同时对抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性有抑制作用。胞外多糖溶液浸种处理在一定程度上可以显著降低MDA含量，提高抗氧化酶活性。酸胁迫下，水稻幼芽的MDA含量较CK显著增加，而经过胞外多糖浸种处理可以显著降低MDA含量，当多糖浓度为200 mg·L-1时，MDA含量与CK间无显著性差异。

酸胁迫对水稻幼芽的CAT、POD、SOD活性均有抑制作用，与 CK相比，分别降低了 54.8%、32.8%、1.4%。添加胞外多糖可以显著提高抗氧化酶活性，且不同浓度胞外多糖对抗氧化酶活性的促进作用存在差异。 当胞外多糖浓度为 20 mg·L-1时，CAT、POD、SOD活性与酸胁迫下不添加多糖相比，分别提高了60.7%、46.9%、31.0%，达到与无胁迫处理时相近的活性。

2.1.4 酸胁迫下胞外多糖对水稻幼苗各项生理指标的影响 由表2可知，酸胁迫的水稻幼苗与CK相比，其叶长、株高、根长、总根数和鲜重分别降低了13.40%、10.29%、27.61%、19.79%和 19.57%。 随着胞外多糖浓度的增加，其对水稻幼苗的酸毒害缓解作用逐渐增强。胞外多糖浓度为200 mg·L-1时，其对胁迫处理后的水稻幼苗生长有显著的缓解作用，与不添加胞外多糖相比，第20天时水稻叶长、株高、根长、总根数和鲜重分别提高了16.82%、10.13%、14.70%、12.91%、5.97%。由表3可知，不同处理下的水稻幼苗叶片的MDA含量、CAT、POD和SOD活性虽有一定的差异，但均未达到显著水平(P＞0.05)。

图2 不同浓度胞外多糖对酸胁迫下水稻MDA含量和抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on MDA content and the activity of antioxidant enzymes in rice under acid stress

表2 不同浓度胞外多糖对酸胁迫下水稻幼苗生理指标的影响Table2 Effect of different concentrations of extracellular polysaccharide on physiological indexes of rice seedlings under acid stress

2.2 盐胁迫下胞外多糖对水稻种子萌发及生理特性的影响

2.2.1 盐胁迫下胞外多糖对水稻种子发芽势、发芽率的影响 由表4可知，盐胁迫对水稻种子的发芽势、发芽率及发芽指数均有显著的抑制作用，与CK相比，分别降低了76.1%、47.9%、67.2%。胞外多糖浸种处理对盐胁迫下的水稻种子萌发具有一定的促进作用，且随着胞外多糖浓度的增加，其对种子萌发的促进作用呈先增加后降低趋势。其中胞外多糖为200 mg·L-1时效果最好，与不添加胞外多糖的盐胁迫时相比，发芽势、发芽率、发芽指数分别提高了152.9%、73.8%、103.0%。

表3 不同浓度胞外多糖对酸胁迫下水稻幼苗MDA含量及抗氧化酶活性的影响Table3 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on MDA content and the activity of antioxidant enzymes in rice seedlings under acid stress

图3 不同浓度胞外多糖对盐胁迫下水稻根长、芽长、根鲜重、芽鲜重的影响Fig.3 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on root length，shoot length，root fresh weight and fresh weight of rice under salt stress

2.2.2 盐胁迫下胞外多糖对水稻种子根长、芽长及根鲜重、芽鲜重的影响 由图3可知，盐胁迫下，水稻幼芽和根系生长均受到显著抑制。与CK相比，盐胁迫下的种子芽长和根长分别减少34.5%、71.9%，芽鲜重和根鲜重分别降低35.2%、77.8%。胞外多糖处理对芽长无显著作用，但对芽鲜重有一定的促进作用，且随着胞外多糖浓度的增加，其对芽鲜重的促进作用逐渐增加。胞外多糖浓度为200 mg·L-1时，其对根长、芽鲜重、根鲜重的促进作用效果较显著，与盐胁迫不添加多糖相比分别增加了187.5%、32.6%、134.6%。

表4 不同浓度胞外多糖对盐胁迫下水稻种子萌发的影响Table4 Effect of different concentrations of exopolysaccharideson rice seed germination under salt stress

2.2.3 盐胁迫下胞外多糖对水稻种子MDA含量及抗氧化酶活性的影响 由图4可知，盐胁迫对水稻MDA含量及抗氧化酶活性的影响与酸胁迫条件下的变化趋势基本一致。盐胁迫不添加多糖条件下，与CK相比，其水稻幼芽中的MDA含量上升了24.8%，胞外多糖处理后，其含量有所降低其中胞外多糖浓度为200 mg·L-1时，MDA含量达到最低，与不添加胞外多糖的盐胁迫相比降低了63.3%。但当胞外多糖浓度为2 000 mg·L-1时，其对MDA含量降低的作用减弱。盐胁迫下，水稻幼芽CAT、POD、SOD活性均降低，分别降低了37.1%、93.2%、17.3%。胞外多糖浸种后，3种抗氧化酶活性均有不同程度的提高，且随着胞外多糖浓度的增加，活性逐渐上升。

图4 不同浓度胞外多糖对盐胁迫下水稻MDA含量及抗氧化酶活性的影响Fig.4 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on MDA content and the activity of antioxidant enzymes in rice under salt stress

2.2.4 盐胁迫下胞外多糖对水稻幼苗各项生理指标的影响 由表5可知，盐胁迫对水稻幼苗的生长有显著的抑制效果。盐胁迫不添加多糖条件下的水稻幼苗与CK相比，叶长、株高、根长、总根数、鲜重分别降低了16.39%、11.14%、32.54%、14.36%、19.57%。 随着浸种胞外多糖浓度的增加，对水稻幼苗的缓解作用呈先增加后降低趋势。其中，胞外多糖浓度为200 mg·L-1时，对水稻幼苗的缓解效果最为显著，幼苗生长第20天，与不添加胞外多糖相比，叶长、株高、根长、总根数、鲜重分别提高了17.80%、9.17%、16.87%、11.81%、19.40%。

由表6可知，不同处理间的水稻幼苗叶片MDA含量及CAT、POD、SOD活性均存在差异，但未达到显著水平(P＞0.05)。

表5 不同浓度胞外多糖对盐胁迫下水稻幼苗各项生理指标的影响Table5 Effect of different concentrations of extracellular polysaccharide on physiological indexes of rice seedlings under salt stress

表6 不同浓度胞外多糖对盐胁迫下水稻幼苗MDA含量及抗氧化酶活性的影响Table6 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on MDA content and the activity of antioxidant enzymes in rice seedlings under salt stress

3 讨论

利用多糖浸种可以缓解胁迫对植株造成的伤害。研究发现植物多糖[19]、动物多糖[20]等均能够增强植物抗逆性，其中微生物多糖因具有安全无污染、易提取等优点而备受人们关注。Sandhya等[21]从向日葵根际土中分离获得一株在干旱胁迫下高产胞外多糖的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)GAP-P45，发现在干旱胁迫下接种GAP-P45对向日葵幼苗的存活率、生物量、根冠比等指标均有显著影响，且明显增强了向日葵幼苗对干旱胁迫的适应能力；Xu等[22]研究发现蓝藻多糖对灌木柠条种子的发芽率和幼苗代谢活性均有显著提高的作用，并通过清除活性氧、提高抗氧化酶活性等方式减少植物的氧化损伤，可作为恢复荒漠地区生态系统的潜在生物肥料；刘偲嘉[23]研究表明，胶冻类芽孢杆菌胞外多糖可以显著提高多种蔬菜、烟草等植物的抗氧化酶活性，诱导植物产生抗逆性。本试验结果表明，乳酸菌胞外多糖浸种能够提高酸、盐胁迫下水稻种子的发芽势、发芽率和发芽指数，促进水稻根系的生长，抑制水稻MDA含量，提高抗氧化酶活性，从而改善逆境胁迫对水稻种子造成的伤害。这与前人研究[21-23]结果基本一致。此外，本研究发现不同胞外多糖浓度对植物受胁迫的缓解作用不同，因此在实际应用中，需要根据不同植物和胁迫环境条件，选择适宜的胞外多糖浓度。

研究表明，酸、盐胁迫导致水稻幼芽的抗氧化系统活性不同程度地降低，进而对植株造成损伤[24]。MDA是细胞膜脂过氧化的产物，其含量反映了细胞氧化损伤的程度[25]，因此MDA含量常作为评价植物膜脂过氧化的重要指标[26]。本研究发现逆境胁迫会显著提高水稻幼芽MDA含量，通过利用胞外多糖浸种后，可显著降低水稻幼芽的MDA含量，表明胞外多糖可以显著降低细胞膜脂过氧化，减少活性氧的产生，缓解胁迫对水稻的过氧化伤害。这与曹君等[27]的研究结果基本相同。此外，Yang等[28]研究也表明，解淀粉芽孢杆菌胞外多糖具有较强的抗氧化性，能够显著抑制MDA的形成。抗氧化酶能够清除植物体内活性氧，以维持活性氧代谢平衡，避免过量活性氧对植物造成的伤害[29-30]，是评价植物抗性的重要指标[31-32]。本研究结果表明，酸、盐胁迫会导致水稻幼芽的抗氧化酶不同程度地降低，而通过乳酸菌胞外多糖浸种后，水稻幼芽的 CAT、POD、SOD活性均显著提高，这与 Tewari等[33]的研究结果相似。研究发现胁迫导致植物抗氧化酶活性变化会随着植物基因型的不同而存在较大差异[34]，某些胁迫条件下植物的抗氧化酶活性会显著上升，这可能是由于胁迫条件导致作物的萌发和正常生理代谢严重紊乱，造成作物的抗氧化酶系统会产生不同方向的变异，进而影响作物的生长和代谢。

乳酸菌作为一类益生菌，其安全性被世界广泛认可，所产的胞外多糖是一类具有抗氧化[35]、抗肿瘤[36]、免疫调节[37]等生物活性的糖类大分子[38]，在食品等领域有广泛应用[39]，但在诱导植物抗逆性方面的应用较少。本研究表明，乳酸菌胞外多糖对酸、盐逆境胁迫下水稻种子萌发具有显著的缓解作用，能够提高水稻种子抗氧化酶活力，这为乳酸菌胞外多糖增强植株抗逆性方面的研究提供了理论依据。

4 结论

利用乳酸菌胞外多糖浸种可有效改善酸、盐胁迫下水稻种子的萌发和苗期生长，缓解酸、盐胁迫对水稻造成的毒害，其中以200 mg·L-1胞外多糖的效果最为显著。本研究为微生物源物增强水稻抗逆性的应用提供了理论依据。今后可考虑采用代谢组学等新方法，进一步考察微生物多糖对胁迫条件下植物代谢的影响，进而阐明其作用机理。