亚东黑耳的氨基酸特征分析及蛋白质品质评价

陈洪雨 鲍大鹏 杨瑞恒 王 莹 高英女 李 燕 吴莹莹

(上海市农业科学院食用菌研究所/国家食用菌工程技术研究中心/农业部南方食用菌资源利用重点实验室，上海 201403)

亚东黑耳(Exidiasp.)为黑耳属物种，是产自西藏亚东地区的珍稀大型食用真菌，曾一度被误认为是黑木耳(Auricularia heimuer)[1-3]。亚东黑耳主要集中分布于西藏自治区日喀则市亚东县的下亚东和下司马镇的林区灌木丛中，且仅专一性地寄生于峨眉蔷薇的枯枝上[1]。目前，亚东黑耳仅能天然采收，尚未实现人工栽培，故鲜见有关亚东黑耳的研究报道。熊卫萍等[1]通过形态学和分子系统学明确了亚东黑耳为黑耳属(ExidiaFr.)的一个种，与其遗传距离最近的是短黑耳(Exidiarecisa)，且亚东黑耳与木耳属(Auricularia)的黑木耳在聚类分析中分属于2个不同的分支，亲缘关系较远。李兆坤等[2]研究了亚东黑耳菌丝的发酵条件，并对其菌丝的人工培养条件进行探索，发现初始pH值和温度对次级代谢多样性的影响较为明显。

食用真菌是优质的膳食蛋白来源，常见市售食用菌蛋白质含量充足、必需氨基酸种类丰富，且品质优于许多果蔬和谷物[4-5]。蛋白质品质是膳食营养的重要评价指标[6-7]，其评价方法主要依据平衡模式谱[8-10]。早期世界卫生组织等机构依据鸡蛋蛋白氨基酸组成和人体氮平衡发布的模式谱至今仍广为使用[11-13]，且在临床营养学数据的支持和推动下，国际营养学界已经推行了两种新的氨基酸平衡模式谱。将人群适应性、蛋白质生物利用率、食物矩阵等因素纳入考量范围后，现行平衡模式谱主要包括世界卫生组织/粮农组织/联合国大学(World Health Organization/Food and Agricultural Organization/United Nation University，WHO/FAO/UNU)联合发布的模式谱和美国国家科学院医学研究所(Institute of Medicine，IOM)提出的模式谱[8-10]。基于氨基酸模式谱确立的各参数模型是氨基酸营养特征分析和蛋白质品质评价的重要依据。

亚东黑耳作为一种稀有的野生食用菌资源，由于样本不易取得，其营养价值尚无系统测评，氨基酸特征和蛋白质品质未见报道。本研究以采自西藏亚东地区的野生黑耳为样品，首次引入了现行国际最新版氨基酸平衡模式谱，并结合常见模型对亚东黑耳的氨基酸特征和蛋白质营养进行了全面评价，以期为食用菌营养研究和黑耳产品开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚东黑耳样品采自西藏自治区日喀则市下辖亚东县的林区灌木丛，收集了5个采样地点的蔷薇枝条上的野生黑耳子实体，将500 g新鲜野生黑耳样品晾晒制成干品后，充分混合后备用。黑木耳1为吉林省蛟河市黄松甸食用菌大市场购得的人工栽培黑木耳干品。黑木耳2为黑龙江省牡丹江市海林黑木耳基地提供的人工栽培黑木耳干品。

硼酸、浓硫酸(98%)、浓盐酸(37%)、氢氧化锂、氢氧化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。茚三酮和缓冲液为日本日立集团提供的氨基酸分析仪配套试剂。

1.2 主要仪器与设备

DT-100高速粉碎机，上海机械设备有限公司；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱，上海精密实验设备有限公司；835-50氨基酸自动分析仪，日本日立公司；Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪，丹麦FOSS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理 将预混合好的黑耳样品和不同木耳样品分别用高速粉碎机粉碎并过20目筛，采用四分法[14]取样待测。取样后，将样品置于70℃烘箱内干燥4 h并储存于干燥器中备用。

1.3.2 样品水分的测定 参照标准GB 5009.3-2016[15]的方法，采用直接干燥法在110℃烘箱中将样品烘干至恒重后称重。

1.3.3 样品粗蛋白测定 参照标准GB5009.5-2016[16]，采用自动凯氏定氮仪测定样品中的粗蛋白含量。

1.3.4 样品氨基酸的测定 采用氨基酸自动分析仪分析样品中的氨基酸。根据GB 5009.124-2016[17]中的酸水解法测定天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸含量；采用GB/T 18246-2000[18]中的碱水解法测定色氨酸；采用GB/T 15399-94[19]中的过氧化酸氧化合并酸水解法测定含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸)。

1.3.5 样品特征参数分析 各参数均采用现行最新标准计算。

氨基酸评分(amino acid score，AAS)依据 WHO/FAO/UNU提出的标准[9]计算:

化学评分(chemical score，CS)采用FAO推荐的标准[20]计算得出:

比值系数(ratio coefficient，RC)和氨基酸比值系数分(score of RC，SRC)根据朱圣陶等[21]的模型计算:

式中，RC为被测食物蛋白质中的第i种必需氨基酸的比值系数；为被测食物蛋白质中的各比值系数的均值；n为必需氨基酸数量。

必需氨基酸指数(essential amino acid index，EAAI)依据Oser[22]提出的方法计算:

式中，p表示样品中必需氨基酸；s表示模式谱中必需氨基酸；n为必需氨基酸数量。

蛋白质校正氨基酸计分(protein digestibility corrected amino acids score，PDCAAS)根据 WHO/FAO/UNU的方法[10]计算:

2 结果与分析

2.1 亚东黑耳中粗蛋白的分析

2.1.1 亚东黑耳的粗蛋白含量 由表1可知，亚东黑耳中粗蛋白含量为8.29 g·100g-1干重(8.29%DW)，总氨基酸含量为6.57 g·100g-1干重(6.57%DW)，略高于施树等[23]报道的亚东地区的黑木耳中粗蛋白含量(7.58%DW)和总氨基酸含量(占干重6.37%)，但低于西藏其他地区采集的野生黑木耳[23]的粗蛋白含量(占干重14.21%～17.14%)，也低于黑木耳1、黑木耳2及人工栽培的黑木耳[24](表1)。此外，亚东黑耳的粗蛋白含量介于常见作物之间，但低于常见食用菌(表2)。

表1 木耳目代表性食用菌的粗蛋白含量Table1 Crude protein contents in typical Auriculariales foods

表2 常见作物及食用菌的粗蛋白含量Table2 Crude protein contents in crops and edible fungi

2.1.2 氮对蛋白折算系数 经测定，亚东黑耳的总氨基酸含量占粗蛋白测定量的79.2%。经计算，亚东黑耳中的氮对蛋白折算系数为4.95，接近常见食用菌中测得的4.7[29]，低于传统使用的一般食物的折算系数(6.25)和主要粮食及经济作物的折算系数(5.30～6.25)[16]，表明食用菌中氮对蛋白折算系数具有一定的特殊性。

2.2 亚东黑耳的氨基酸组成分析

亚东黑耳中含有常见的18种氨基酸(表3)，总量为65.74 mg·g-1DW，其中必需氨基酸(EAA)为25.17 mg·g-1DW，占总氨基酸(TAA)的38.29%，非必需氨基酸(NEAA)为 40.57 mg·g-1DW，占总氨基酸的61.71%，必需氨基酸/非必需氨基酸值(EAA/NEAA)为62.04%，超过60%，符合FAO/WHO提出的理想蛋白模式。亚东黑耳包含全部8种必需氨基酸，其中亮氨酸含量最高(5.62 mg·g-1DW)。

表3 亚东黑耳的氨基酸组成Table3 The compositions of the amino acid in proteins of Exidia sp.

2.3 亚东黑耳蛋白质的营养评估

2.3.1 亚东黑耳蛋白质中必需氨基酸的组成分析由表4可知，亚东黑耳含有丰富的必需氨基酸，其总含量为473.43 mg·g-1pro，高于常见粮食及经济作物(273～420 mg·g-1pro)[31-33]，但作为优质植物蛋白源的大豆(369.4～427.0 mg·g-1pro)[34-35]，介于常见食用菌蛋白氨基酸含量(370.0～668.4 mg·g-1pro)之间[4，29]。亚东黑耳的必需氨基酸含量完全满足且超过了WHO/FAO/UNU推荐的平衡模式参考值、IOM推荐模式参考值和FAO根据鸡蛋蛋白改良采用的模式值，表明亚东黑耳是必需氨基酸充足的优质蛋白源。

表4 亚东黑耳蛋白中必需氨基酸的组成及比较分析Table4 Comparison of essential amino acids in proteins of Exidia sp. /(mg·g-1pro)

就单个氨基酸含量而言，亚东黑耳蛋白中的各个氨基酸基本满足WHO/FAO/UNU(2007年)和IOM推荐的平衡模式(2005年)的需求，但除苏氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸外的其他氨基酸含量均低于FAO鸡蛋蛋白模式(1984年)。

2.3.2 亚东黑耳蛋白质的氨基酸营养特征分析 氨基酸评分(AAS)，即待测蛋白质中某一必需氨基酸占WHO/FAO/UNU评分模式中相应氨基酸含量的百分比，是当前评价氨基酸营养价值的主要指标[10]。亚东黑耳蛋白中除异亮氨酸外的其他必需氨基酸AAS值均大于100%(表5)，而依据现行标准计算得出的第一限制氨基酸-异亮氨酸的AAS值(98.75%)也接近100%。因此，亚东黑耳蛋白基本满足 WHO/FAO/UNU推荐模式所要求的必需氨基酸供给，是必需氨基酸平衡充分的优质蛋白源[9]。

依照IOM提出的参照标准，亚东黑耳蛋白质中所有必需氨基酸的评分均超过100%，符合完全蛋白质的标准，可提供充足比例的、满足人类需求的必需氨基酸，成为除传统完全蛋白源如蛋乳制品、肉类食品和豆制品外新的完全蛋白来源[8]。与鸡蛋蛋白质改良模式相比[20]，亚东黑耳蛋白质中必需氨基酸的平衡性和含量略逊色于鸡蛋蛋白质，4类氨基酸(色氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸＋半胱氨酸、缬氨酸)的CS值低于或接近80%。尽管亚东黑耳蛋白质营养价值不如鸡蛋蛋白质，但其仍属于优质蛋白资源，可作为辅助食材与其他食物进行营养搭配。

在氨基酸平衡性分析中，亚东黑耳的氨基酸比值系数(RC)为0.74～1.66，苏氨酸和异亮氨酸分别正负向偏离平衡谱最远，蛋氨酸＋半胱氨酸最接近于1。依据朱圣陶等[21]的方法计算得到亚东黑耳氨基酸比值系数分(SRC)为70.93，该值高于部分粮食作物如高粱(47.33)和小米(53.15)，接近大米(70.50)和小麦(72.47)，略微逊色于鸡蛋(81.22)。

2.3.3 亚东黑耳蛋白质的必需氨基酸指数分析 必需氨基酸指数(EAAI)是指以几何平均数模型衡量蛋白样本所含有的必需氨基酸相比于一种高价参比蛋白质所含必需氨基酸的整体情况[22]。经计算，亚东黑耳蛋白质的EAAI值为129.11，说明亚东黑耳蛋白质中必需氨基酸的分布与各参照模式相比较为平衡。

2.3.4 亚东黑耳蛋白质校正氨基酸计分 蛋白质校正氨基酸计分(PDCAAS)即经蛋白质消化率校正过的AAS，该模型将蛋白质的吸收利用优化纳入了蛋白质质量评估的范畴[10，36]。根据食用菌的消化率(73%)[37]计算，亚东黑耳的PDCAAS值为0.72，高于约旦地区的糙皮侧耳、沙漠松露、棕灰口蘑和大孢蘑菇4种蘑菇(PDCAAS值 0.35～0.45，消化率 61.4%～80.5%)[38]。

表5 亚东黑耳蛋白质的氨基酸营养特征分析Table5 Nutrition profile of amino acids in proteins of Exidia sp.

3 讨论

亚东黑耳是专性寄生的野生食用菌，为黑耳属物种而非木耳[1，3]。本研究首次对亚东黑耳的氨基酸和蛋白质进行了含量测定和营养价值评价。食品中粗蛋白和氨基酸含量与环境中氮磷等元素的水平有关[39-40]。亚东黑耳粗蛋白含量为8.29%，在食物中处于中等水平[28，31，33]，而亚东黑耳中必需氨基酸总含量达到473.4 mg·g-1pro，高于常见粮食及经济作物，如大豆、小米、小麦、花生等[31，33，35]，与常见食用菌的必需氨基酸含量相近[4，29]。亚东黑耳的必需氨基酸总含量符合且超过了主要的氨基酸模式谱，如WHO/FAO/UNU模式、IOM推荐模式和FAO鸡蛋蛋白模式[8，9，20]的需求。本研究结果表明，亚东黑耳的必需氨基酸中亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸相对含量较高，其中，亮氨酸对机体脂质代谢、血糖平衡和蛋白质合成分解等生理机能的维护有关键作用[41]；苏氨酸是多种其他氨基酸的前体，对细胞功能和生理信号传递有重要影响[42-43]；赖氨酸在钙的吸收中起重要作用，赖氨酸水平影响多个生理过程，如肌肉中蛋白质的形成，伤口愈合和荷尔蒙、酶及抗体的分泌[44]。本研究中，亚东黑耳可与第一限制氨基酸为赖氨酸的谷物食品配合食用，以达到氨基酸的平衡摄取，弥补以谷物为主粮时可能出现的赖氨酸缺乏[45]。基于膳食平衡原理，亚东黑耳的第一限制性氨基酸为异亮氨酸，必要时可以通过鸡蛋、大豆蛋白质、海苔、鸡肉、鱼肉和其他动物食品补充[46]。

依据必需氨基酸平衡模式谱进行参数评估是分析氨基酸营养特征的主要方法[10，36]。 WHO、FAO、IOM及其合作机构曾多次改良氨基酸营养价值评估方法和平衡模式谱，从早期的鸡蛋蛋白质模型、人体氮平衡模型逐步优化到现行的综合考虑蛋白质生物利用率，针对人群蛋白质摄入需求和在食物矩阵中吸收情况的模型，并不断根据临床营养学研究进展及其数据库的更新来优化氨基酸平衡模式谱[6，36]。依据现行的模型计算，亚东黑耳中各必需氨基酸分布基本符合要求，作为第一限制氨基酸的异亮氨酸AAS评分为98.75%，也接近100%。按照IOM提出的标准，亚东黑耳蛋白属于完全蛋白质，因此，除鸡蛋、乳制品、动物食品、豆制品、土豆、西蓝花、腰果及配方谷物食品等完全蛋白质食物来源外，亚东黑耳蛋白质作为新发现的完全蛋白质，为营养配餐和口味改善等提供了新的可能。本研究引入WHO/FAO/UNU和IOM提出新的标准对亚东黑耳进行了评估，而国际评价标准是依据居民膳食蛋白摄入需求的变化逐步修订的，在此推荐研究学者采用新的标准对食品中氨基酸营养进行再评价[47]。

4 结论

本研究首次引入国际最新的氨基酸平衡模式谱，通过系统分析对亚东黑耳的氨基酸特征和蛋白质品质进行评估。结果表明，亚东黑耳蛋白质中的必需氨基酸含量非常充足，比例基本合理，符合国际推行的氨基酸平衡模式谱。由于受到野生资源的产量限制，黑耳资源尚未被充分利用。随着亚东黑耳人工栽培技术的开发和推广，可实现其大规模生产。本研究结果为进一步发掘和利用亚东黑耳的营养价值奠定了科学基础。