D-Optional混料设计优化油茶壳瓶栽海鲜菇配方

卢剑青， 艾啸威， 胡冬南， 沈勇根， 周 明， 朱凤妮， 王 强

(1.江西农业大学食品科学与工程学院/江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌 330045；2.江西农业大学林学院，江西南昌 330045)

油茶(CamelliaOleiferaAbel)别称茶油树，为山茶科山茶属植物，同油棕、椰子、油橄榄一起被人们誉为世界四大木本油料树种[1]。据报道，中国是世界上油茶品种最多、种植面积最大、分布最广、茶籽产量亦是最高的国家，已有 26.67万hm2的油茶林种植面积[2]。油茶壳含油率低、木质素高，将油茶籽带壳加工制油，不仅会增大对设备的损耗，而且还会降低茶油的品质，所以在制油工业中都是对油茶籽进行脱壳处理，油茶壳成了茶油加工中的主要废弃物。海鲜菇[Hypsizygusmarmoreus(Peck) H.E.Bigelow]是一种珍稀的食用菌，其商品名为真姬菇，别称白玉菇、玉蕈、斑玉蕈或蟹味菇等。海鲜菇整体颜色洁白，菇柄笔直，外形十分美观，口感爽滑、脆嫩，味道鲜美。海鲜菇风味鲜美类似海蟹风味、营养价值高，并且海鲜菇还有着很高的药用价值，经国内外对海鲜菇的研究发现，海鲜菇子实体中含有多种生物活性物质，如具有清除自由基[3]、抗肿瘤[4]以及调节免疫活性[5]等生理功能，近年来广受大众欢迎。将油茶壳废料应用到食用菌生产中作栽培基质，在获得风味独特的食用菌同时，消化油茶加工过程中产生的剩余物，使资源得到充分高效循环利用。大量研究表明，油茶壳经过堆沤发酵后，碳氮比会降低(即油茶壳的含氮量提高)，颗粒度变小使保水能力增强，经过半年的发酵，油茶壳的碳氮比高达21.42 ∶1，发酵后的油茶壳很适合用作食用菌的栽培原料[6]。这在凤尾菇[7]、黑木耳[8]、香菇[9]、金针菇[10]、平菇[11]等几种食用菌的栽培中已有应用，并且使用油茶壳栽培食用菌后，食用菌生长速率快、产量高、生物学效率高、品质好。目前，在海鲜菇生产企业中主要采用棉籽壳来栽培海鲜菇，但棉籽壳的原料价格一直居高不下，海鲜菇的经济收益低，因此海鲜菇科技工作者开始研究新型栽培料代替传统原料来生产海鲜菇，以降低海鲜菇生产成本，提高效率。本研究将油茶壳应用到海鲜菇生产中作栽培基质，采用混料设计方法，以油茶壳、棉籽壳、混合料(木屑、麦麸、玉米粉)为主要原料，以栽培周期、产量、子实体农艺性状和营养价值为评价指标，设计16组配方进行栽培试验，分析并筛选出适宜海鲜菇工厂化栽培的优势配方。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海鲜菇菌种，由江西星火农林科技有限公司提供；油茶壳，经堆沤发酵，由江西星火农林科技有限公司提供；海鲜菇母种培养基包括马铃薯200 g、琼脂粉18 g、葡萄糖20 g、水 1 000 mL 等，市购；海鲜菇原种培养基包括棉籽壳26.7%、木屑53.3%、玉米粉3.3%、麦麸16.7%，其中石灰粉和石膏粉的用量占培养基干质量的1%，市购；海鲜菇栽培种培养基包括油茶壳、棉子壳、杂木屑、麦麸粉、玉米粉、石灰粉，棉籽壳和油茶壳作为主料，杂木屑、麦麸粉以及玉米粉按固定比例(4 ∶3 ∶1)混合作为混合料，市购；过氧化氢、氢氧化钠、浓硫酸、浓盐酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、无水乙醇、甲基红、溴甲酚绿、过氧化氢、十二烷基三甲基溴化氨、正丁醇、丙酮、石油醚等，分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

超净工作台，上海康福特环境科技有限公司；HVE-50灭菌锅，日本Hirayama制造有限公司；DHP-9272恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；BZ-10-12型马弗炉，上海博珍仪器设备制造厂；BAS124S型分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；BZ-10-12型马弗炉，上海博珍仪器设备制造厂；Foss8400型全自动凯氏定氮仪，广东省广州赛为思仪器设备有限公司；DT208型样品消化炉，广东省广州赛为思仪器设备有限公司；SHZ-ⅢD型真空抽滤机，上海亚京生化仪器厂；HH-4型电热水浴锅，国华电器有限公司；HJ-3型磁力搅拌器，国华电器有限公司；101A-4B型电热恒温箱，上海市试验仪器总厂。

1.3 试验方法

1.3.1 混料配方设计 采用D-Optional混料设计法，根据海鲜菇对碳源和氮源的营养需要，调整棉籽壳、油茶壳及混合料所占培养基干料的比例，石灰粉的添加量固定为培养基干质量的1.4%，以期建立各因子对海鲜菇生长周期、产量及农艺性状的回归方程，通过统计软件来优化海鲜菇的生产配方。在采用D-Optional优化处方工艺前，各因素需要1个较优范围，以便于保证优化设计的精确性。本研究前期通过查阅大量文献以及根据实际生产经验得出结果，将3种栽培料的添加量分别限定为：0≤棉籽壳添加量(A)≤70%，0≤油茶壳添加量(B)≤70%，30%≤混合料添加量(C)≤50%；A、B、C均为实际值，且A+B+C=1。根据D-Optional设计出16组配方，具体结果见表1。同时，以传统未加油茶壳的配方(棉籽壳添加量65%、混合料添加量35%)进行对比，每组配方做32次重复试验。

表1 培养基配方设计

1.3.2 各级种子的制备

1.3.2.1 母种斜面的制备 先挑取母种转接到马铃薯琼脂培养基(PDA)上，于恒温培养箱20～22 ℃遮光培养，3 d后母种萌发菌丝，15～20 d后雪白的菌丝长满整个试管。将培养好的马铃薯琼脂斜面培养基(PDA)试管的培养物放在4 ℃下保藏，作为母种斜面。

1.3.2.2 原种的制备 (1)培养基的制备。称取200 kg棉籽壳、400 kg杂木屑分别先用水浸泡12 h以上，再将浸泡好的棉籽壳、杂木屑同125 kg麦麸、10 kg玉米粉、7.5 kg石灰粉以及7.5 kg石膏进行搅拌均匀，加水至培养料的含水量为65%为止。随后进行装瓶，于121～123 ℃下湿热高压灭菌处理20 min；待灭菌完成后，将培养料冷却至室温，方可用于后续接种试验。(2)原种的制备。取出制备好的母种斜面试管，用接种环将母种斜面平均切成3～4块，分别放入原种瓶中，每支母种斜面试管接3～4个原种瓶，最后将接种好的原种瓶直接摆放在原种培养房的培养架上，于22～25 ℃下暗培养 30～40 d，室内的相对湿度(RH)控制在65%～75%。待培养好的原种瓶内的培养物作为原种。

1.3.2.3 栽培种的制作 (1)拌料。将预先处理好的油茶壳、棉籽壳、杂木屑、麦麸、玉米粉栽培料、石灰粉按比例堆放在一起，用铁锹不断搅拌均匀，加入适量水，直到混合料的含水量为65%上下为止。(2)装瓶及接种。将拌好的混合料按300 g分装于栽培瓶(1 100 mL)，且保证每瓶料的松紧度和高度一致，于121～123 ℃下高压灭菌20 min。待灭菌完成且冷却至室温后，将制备好的原种接种于无菌的栽培瓶中，于培养室22～25 ℃下暗培养和后熟一段时间，且室内的相对湿度控制在65%～75%。(3)搔菌。待海鲜菇成熟后进行搔菌，将菌瓶放在搔菌机上，机器把菌瓶上部与瓶盖接触的那部分老菌丝挖掉，搔菌后每瓶加入10～15 mL的水，5 min后把水倒出，然后把菌瓶转移至出菇房进行出菇管理。为保证菌瓶正常出菇，将出菇房中的温度控制在13～15 ℃，相对湿度控制在85%，再把无纺布盖在菌瓶面上避免空调机吹出来的风直接打在料面上。待3～5 d的暗培养后，用150～200 lx的光线对其进行照射，10～15 d后瓶口出现小菇芽，可揭开无纺布，以保证正常出菇，此时将出菇房的相对湿度控制在90%。待海鲜菇菇帽出现菌环时，表明海鲜菇已经成熟，必须马上采摘，否者会形成“大帽子菇”影响海鲜菇的商品价值。

1.3.3 试验各指标测定方法

1.3.3.1 海鲜菇栽培周期指标的测定方法 采用观察法，观察并记录接种好的栽培瓶内海鲜菇菌丝长满至全瓶所需要的时间和出菇至菇芽成熟所需要的时间，这两者之和即为海鲜菇的栽培周期。

1.3.3.2 海鲜菇子实体产量指标的测定方法 子实体的产量采用直接称质量法，将采摘后的子实体用电子天平称质量。

1.3.3.3 海鲜菇子实体农艺性状指标的测定方法 结合工厂生产对海鲜菇子实体实际需要，采用测量评分法，待出菇至菇芽成熟结束后，按表2进行评分。

1.3.3.4 海鲜菇子实体营养指标的测定方法 含水量参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中直接干燥法进行测定[12]；灰分含量的测定参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中进行测定[13]；粗蛋白质含量参照GB 5009.5—2016 《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中全自动凯氏定氮仪法进行测定[14]；粗纤维含量采用酸性洗涤剂法进行测定[15]；粗脂肪含量参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中索氏提取法进行测定[16]。

表2 子实体农艺性状的评分标准

2 结果与分析

2.1 不同配方海鲜菇子实体比较

不同配方海鲜菇子实体的生长情况见图1。

2.2 不同配方对海鲜菇栽培周期、子实体产量及农艺性状的影响

将成熟的海鲜菇子实体采下，测量不同配方海鲜菇子实体的数量、菇柄直径及其长度、菇帽的直径，并根据表2中评分标准对海鲜菇子实体进行评分，评分结果见表3。

2.2.1 不同配方对海鲜菇栽培周期回归分析结果 根据所得到的试验结果，对海鲜菇栽培周期的数据进行回归拟合。根据拟合结果，该模型拟合有统计学意义(P=0.012 1<0.05)，对试验数据进行回归分析，得到回归方程：y=48.882A+88.702B+10.478C-61.824AB+394.419AC+228.249BC。从表4可以看出该模型的P值=0.001 1，达显著水平，失拟项为0.106 6，不显著，确定系数R2=0.835 1>0.7，说明83.51%的试验数据可以用该模型解释，表明该模型拟合效果较好。

由图2可知，当混合料添加量占较大的比例，随着棉籽壳添加量增加，海鲜菇的生长周期逐渐延长，随着油茶壳的添加量不断增加，海鲜菇的生长周期先是不断缩短再开始缓慢延长，在油茶壳添加量为50%时，海鲜菇的生长周期最短。油茶壳经过发酵后，原料的持水性得到提高，同时发酵后的油茶壳中的营养物质易被海鲜菇菌丝吸收，随着油茶壳的添加量增加，海鲜菇生长周期缩短，但是油茶壳添加量过高时，导致培养基整体的透气性下降，影响海鲜菇菌丝正常生长。以海鲜菇子实体栽培周期为评价指标，最佳栽培料的生产配方：油茶壳添加量为50%、棉籽壳添加量为0、混合料添加量为50%，并且预计海鲜菇最短栽培周期是107 d。

表3 不同配方栽培周期、子实体产量及农艺性状评分试验结果

表4 栽培周期回归分析结果

2.2.2 不同配方对海鲜菇子实体产量回归结果 根据所得到的试验结果，对海鲜菇子实体产量的数据进行回归拟合。根据拟合结果可知，该模型拟合有统计学意义(P<0.000 1)，对试验数据进行回归分析，得到回归方程如下：y=91.876A+119.713B+173.053C+214.987AB+459.389AC。从表5中可以看出该模型P值<0.0001，达显著水平，其决定系数R2=0.987>0.7，说明98.7%的试验数据可以用该模型解释，表明该模型拟合效果较好。

表5 子实体产量回归分析结果

由图3中可知，当混合料添加量同时保持不变时，海鲜菇的产量随着棉籽壳的添加量增加而增加，随着油茶壳添加量的增加而减少，在棉籽壳的添加量在50%时，产量有最大值。当油茶壳添加量较少且固定时，海鲜菇产量随着棉籽壳添加量增加而减少，随着混合料添加量增加而增加。这可能是因为油茶壳发酵后致密性增强导致海鲜菇在出菇阶段营养吸收不足，从而导致海鲜菇产量下降。由统计软件预测得出，以海鲜菇子实体产量为评价指标，最佳栽培料的生产配方为：油茶壳添加量0、棉籽壳添加量50%、混合料添加量50%，预计最高产量约为247.3 g。

2.2.3 不同配方对海鲜菇子实体的农艺性状回归分析结果 根据所得到的试验结果，对海鲜菇子实体农艺性状的数据进行回归拟合。根据拟合结果可知，该模型拟合具有统计学意义(P<0.000 1)，对试验数据进行回归分析，得到回归方程如下：y=4.650A-0.089B+2.044C-42.326AB+22.173AC+15.849BC+167.312ABC。从表6中可以看出模型P值<0.000 1，达显著水平，其决定系数R2=0.989 5>0.7，说明98.95%的试验数据可以用该模型解释，表明模型拟合效果较好。

表6 子实体农艺性状回归分析结果

由图4可知，当混合料添加量固定且较大时，海鲜菇子实体农艺性状评分随着棉籽壳添加量增加先提高，当棉籽壳添加量35.5%时，海鲜菇农艺性状评分有最大值，之后随着棉籽壳添加量增大而降低，随着油茶壳添加量增大而提高，直到油茶壳添加量为15.6%时达到最大值，之后随着油茶壳添加量增大而降低。这可能是因为油茶壳致密性高导致海鲜菇在出菇阶段营养吸收不足，从而导致农艺性状评分下降。以海鲜菇子实体农艺性状为评价指标，最佳栽培料的生产配方：油茶壳添加量15.6%、棉籽壳添加量35.5%、混合料添加量48.9%，预计子实体农艺性状得分最高值为9.9分。

2.3 传统生产配方的海鲜菇品质

采用传统工厂生产配方(棉籽壳添加量65%、混合料添加量35%)，按上述相关指标进行测定，得出其生长周期为130 d，产量205 g，农艺性状评分为8.6分。

2.4 工厂化生产配方的设计

为满足工厂化生产的需要，必须结合实际来设计最佳配方，须要考虑以下几点因素：海鲜菇栽培周期时间不能太长，否则会直接加大海鲜菇成本；海鲜菇产量不能太低，否则直接会加大海鲜菇成本；子实体农艺性状不能太差，否则会导致海鲜菇将难以销售。

根据实际生产经验，设定海鲜菇栽培周期的范围在 110～131 d、海鲜菇产量范围在200～251 g、子实体农艺性状评分范围在8.6～9.4分，采用统计软件Design-Expert 8.0.6 进行模型分析，得到最适合工厂化的配方为：油茶壳添加量21.8%、棉籽壳添加量42.8%、混合料添加量35.4%。通过采用统计软件Design-Expert 8.0.6预测该配方栽培周期为115 d、产量为216.4 g、子实体农艺性状评分为8.9分。并对该配方进行验证试验，结果显示，海鲜菇生长周期为 115 d、产量217.1 g、农艺性状为8.8分。与传统未加油茶壳的配方(棉籽壳添加量65%，混合料添加量35%)相比，该配方的生产周期缩短了15 d、产量增加了11.4 g。

2.5 优化配方和传统配方海鲜菇子实体营养品质的比较

由表7可知，采用优化后的配方瓶栽的海鲜菇的灰分、粗蛋白质及粗纤维含量均显著高于传统配方瓶栽的海鲜菇，这可能是油茶壳经过发酵以后，其微量元素、氮、有机质含量增加，导致优化后配方的海鲜菇灰分、蛋白及纤维较高。但2种海鲜菇的水分及粗脂肪含量均无显著的差异，同时其子实体的水分低于91%，有利于海鲜菇的贮藏。采用优化后的配方瓶栽海鲜菇，含水量不仅保持在90%左右，而且脂肪含量低、蛋白质、纤维素含量高，满足人们对营养和健康的要求。

表7 优化配方和传统配方海鲜菇子实体营养品质的比较

3 结论

采用混料设计方法[17]，以油茶壳、棉籽壳、混合料(木屑、麦麸、玉米粉)为主要原料，设计16组配方进行栽培试验，通过对试验数据进行回归分析，建立了栽培周期、产量、子实体农艺性状与响应值的回归方程，分别为：y周期=48.882A+88.702B+10.478C-61.824AB+394.419AC+228.249BC；y产量=91.876A+119.713B+173.053C+214.987AB+459.389AC；y农艺性状=4.650A-0.089B+2.044C-42.326AB+22.173AC+15.849BC+167.312ABC。对回归方程进行方差分析，这3个回归方程的决定系数都大于0.7，结果表明这3个回归方程模型拟合性较好。

从不同配方对栽培周期的影响结果进行分析，当以海鲜菇子实体栽培周期为评价指标时，最佳栽培料的生产配方为：油茶壳添加量50%、棉籽壳添加量0、混合料添加量50%，并预计最短栽培周期为107 d；以海鲜菇子实体产量为评价指标，最佳栽培料的生产配方为：油茶壳添加量0、棉籽壳添加量50%、混合料添加量50%，并预计最高产量为247.3 g；以海鲜菇子实体农艺性状为评价指标，最佳栽培料的生产配方：棉籽壳添加量35.5%、油茶壳添加量15.6%、混合料添加量48.9%，预计子实体农艺性状最高的评分值为9.9分。

工厂化生产海鲜菇需要栽培周期短、产量高以及子实体农艺性状好的生产配方，通过优化计算得到适合工业化生产的配方：油茶壳添加量21.8%、棉籽壳添加量42.8%、混合料添加量35.4%，与传统配方相比，该配方具有栽培周期短、产量高的优势，同时灰分、粗蛋白质及粗纤维含量高。