胃癌个体化免疫治疗新策略研究

张启德，葛蓉，王建宁

肿瘤免疫治疗已成为继手术、放化疗治疗后第4大肿瘤疗法之一[1]。目前应用最广泛的免疫检查点抑制剂，包括CTLA-4、PD-1及其配体PD-L1抑制剂。恶性肿瘤及其微环境中过度表达的程序性死亡配体-1(programmed death ligands 1，PD-L1)与程序性死亡受体-1(programmed death 1，PD-1)结合，激活下游通路，下调抗肿瘤免疫反应，使肿瘤逃逸人体免疫监视及杀伤，促进肿瘤生长。PD-1及PD-L1在多种胃肠道恶性肿瘤中上调，阻断PD-1/PD-L1信号通路为肿瘤免疫治疗提供可能[2]。胃癌作为我国常见恶性肿瘤之一，其预后也与细胞错配修复功能缺失有关[3]。目前已发现错配修复基因有多种，错配修复蛋白hMSH2、hMLH1参与DNA错配修复过程，是其中关键蛋白[4]。因此了解胃癌患者PD-1、PD-L1和错配修复蛋白hMSH2、hMLH1表达与肿瘤临床病理特征的关系，可能为临床选择应用PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗优势人群提供依据。

1 资料与方法

1.1 组织标本 收集南京市江宁医院2015年1月至2016年12月，胃癌根治术后组织学证实为胃癌的石蜡标本76例。所有标本均经4%甲醛固定、石蜡包埋，制成5 μm切片、HE染色后，由两位具有高级职称的病理医师进行病理学诊断。

1.2 免疫组化法检测PD-L1、PD-1和错配修复蛋白hMSH2、hMLH1蛋白表达 免疫组化过程按照PV-9000试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书进行。石蜡切片常规脱蜡水化、3% H2O2避光孵育10 min，PBS缓冲液清洗3次，加入一抗PD-L1、PD-1、hMSH2或hMLH1(均购于英国Abcam公司)，1∶100稀释，PBS作空白对照；4 ℃冰箱过夜，37 ℃复温60 min，应用DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。

1.3 免疫组化结果判定 免疫组化标本由两位高级职称病理科医师独立阅片判定。PD-L1和PD-1蛋白定位于细胞质或细胞膜，hMSH2 和hMLH1蛋白定位于细胞质或细胞核，阳性染色为黄至棕褐色颗粒。均采用二次计分法：每例标本随机计数5个高倍视野(×400)观察并计数阳性染色细胞及其百分比。染色强度分级：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞密度分级：阳性细胞数<10%为1分，阳性细胞数10%～50%为2分，阳性细胞数>50%为3分。两项得分相乘结果≥3分为阳性表达。

1.4 统计学方法 采用GraphpadPrism 6统计软件进行分析，组间差异比较应用χ2检验，采用Spearman等级相关分析胃癌组织中PD-L1、PD-1与错配修复蛋白hMSH2、hMLH1表达的相互关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织PD-L1、PD-1、hMSH2、hMLH1蛋白表达与临床病理特征的关系 胃癌组织中，PD-L1蛋白表达阳性率为47.37%(36/76)，其表达与TNM分期、分化程度、淋巴结转移情况及脉管癌栓有关，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期者PD-L1表达高于Ⅰ、Ⅱ期者(P<0.05)，肿瘤低分化者PD-L1表达高于中分化及高分化者(P<0.05)，发生淋巴结转移者高于未转移者(P<0.05)，而有脉管癌栓者高于无脉管癌栓者(P<0.05)，见表1。

胃癌组织中，PD-1蛋白表达阳性率为39.47%(30/76)，其表达与各临床病理特征均无关(均P>0.05)。胃癌组织中错配修复基因hMSH2 表达阳性率为35.53%(27/76)，hMLH1表达阳性率为38.16%(29/76)，两者表达均仅与TNM分期相关，Ⅲ、Ⅳ期表达高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，见表1。

2.2 胃癌中PD-L1、PD-1与错配修复蛋白hMSH2、hMLH1表达的相关关系 应用Spearman等级相关分析法对PD-L1、PD-1与错配修复蛋白hMSH2、hMLH1表达水平之间的关系分析显示，76例标本中，PD-L1与hMSH2、hMLH1蛋白表达呈正相关(均P<0.05)，而PD-1与PD-L1、hMSH2 、hMLH1蛋白表达均无相关(均P>0.05)，见表2、表3。

表1 胃癌组织PD-L1、PD-1和错配修复蛋白hMSH2、hMLH1表达与肿瘤组织病理的关系

表2 胃癌组织中PD-L1、PD-1和hMLH1、hMSH2表达水平的相关关系

表3 胃癌组织中PD-L1和PD-1表达水平的相关关系

3 讨论

近年来，免疫治疗特别是免疫检查点调节免疫治疗取得较大进步，PD-1、PD-L1免疫检查点抑制剂在多种进展期肿瘤中得到应用。PD-1是近年来发现的负性共刺激信号分子之一，肿瘤组织中淋巴细胞，尤其是活化T细胞均能检测到PD-1蛋白表达。PD-L1与T细胞表面受体PD-1结合后，抑制T细胞活化，诱导抗肿瘤T细胞凋亡，最终是机体抗肿瘤效应降低，引起肿瘤进展。然而，PD-1/PD-L1抑制剂在不同肿瘤的应用结果表明，PD-L1在肿瘤或免疫细胞的表达虽重要，但并非绝对的疗效预测性生物标志[5-6]。更进一步研究表明，PD-1免疫检查点抑制剂pembrolizumab可选择性延长存在基因错配修复基因缺陷的直肠癌患者生存期[7]。错配修复基因缺陷常导致错配修复蛋白表达下降，引起细胞DNA错配无法修复，进而发生细胞恶变产生肿瘤[8]。胃癌组织中，PD-L1与PD-1表达相关性尚无定论。本研究结果表明，PD-L1与PD-1表达无相关，PD-1表达与多项临床病理特征无相关，这可能与肿瘤微环境中存在其他负向免疫调节分子有关[9]。PD-L1表达与总生存期有关，近年来有研究显示，PD-L1在肿瘤表达可作为判断患者预后的重要指标[10]。本研究结果显示，PD-L1阳性表达与肿瘤组织病理特征相关，胃癌组织PD-L1表达与性别、肿瘤部位、肿瘤直径无相关，与肿瘤分化程度、病理分期、淋巴结转移及脉管侵犯相关，低分化、分期晚、有淋巴结转移及脉管癌栓的PD-L1阳性表达率最高，表明PD-L1在恶性程度较高、预后较差的肿瘤组织中表达增高。

Keynote-012研究表明，PD-1抗体Pembrolizumab治疗PD-L1阳性晚期胃腺癌安全有效，将PD-L1阳性作为筛选目标，可选择从PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗中获益的人群[11]。然而研究表明，虽然PD-1抑制剂治疗非小细胞肺癌、黑素瘤及肾癌客观反应率为6%～17%，疾病稳定时间可长达2年，但PD-1抑制剂在其他组织学类型，如胃肠肿瘤和胆胰肿瘤的治疗作用却微不足道[12]。这一现象提示，对于PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂可能存在部分敏感人群，寻找PD-L1以外新的生物标志物可更好预测其疗效。一项PD-1抑制剂前瞻性试验表明，PD-1抑制剂对于错配修复基因缺陷的肠癌能取得良好疗效，MMR缺陷肠癌组的客观缓解率及无进展生存期显著高于MMR正常肠癌组，包括胃癌在内的其他MMR缺陷的肿瘤组客观缓解率也高达60%。研究发现，在MMR缺陷肿瘤组，虽然PD-L1表达仍显著，但PD-L1表达并不与治疗反应独立相关。提示PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂应用对象的选择需从肿瘤类型向分子特征转变[5]。目前对MMR缺陷的检测仅限于怀疑Lynch综合征患者或者早期结肠癌患者，因为MMR缺陷常预示更好预后，部分肠癌患者可避免辅助化疗[13]。研究表明，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂对于MMR缺陷肿瘤广泛有效，后续临床中可扩大对MMR缺陷的检测范围。肿瘤组织中错配修复基因缺陷导致错配修复蛋白表达或功能下降。本研究中，我们同时检测了肿瘤组织PD-L1及错配修复过程中关键蛋白hMSH1、hMLH2表达，表明错配修复蛋白表达与肿瘤临床分期相关，错配修复蛋白表达与PD-L1呈正相关。这一结果与上述前瞻性试验不完全一致，可能与样本量不大且分别从基因和蛋白水平检测有关，后续研究中，我们需完善基因水平的微卫星不稳定检测，以进一步证实实验结果。

综上所述，PD-L1表达与多种胃癌临床病理特征相关，随着胃癌病情发展及恶性程度增高，PD-L1表达阳性率逐渐升高。PD-L1表达与错配修复蛋白表达相关，在应用PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂时同时检测PD-L1及错配修复蛋白表达，更有利于预测药物抗肿瘤效果。