丝裂原活化蛋白激酶在糖尿病神经病理性疼痛中枢敏化和外周敏化中作用的研究进展

张 欣，申 乐，黄宇光

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院麻醉科，北京 100730

糖尿病神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病最常见的并发症之一，是全球重大的公共卫生问题。我国成年人糖尿病的患病率为10.4%，病程较长的患者易发生明显的多神经病变[1]。麻木、疼痛和痛觉异常是DNP的主要症状[1]。近年来有关丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)在DNP中枢和外周敏化中的机制研究越来越多。研究显示，MAPKs的激活与DNP相关[2- 3]。本文主要总结近年来MAPKs在DNP中枢敏化和外周敏化中的机制以及治疗的研究进展。

MAPKs信号通路概述

MAPKs是一组丝/苏氨酸蛋白激酶，能够感受细胞外刺激并引发广泛的细胞内应答。经典的MAPKs由细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1/2/3、p38亚型(α，β，γ和δ)和ERK5组成。每一组经典的MAPKs由MAPK、MAPK激酶(MAPK kinase，MAPKK)、MAPKK激酶(MAPKK kinase，MAPKKK)这3个进化上非常保守的激酶组成，MAPKKK激活后可以激活MAPKK，进而激活MAPK引发一系列下游的生物学效应，能够介导增殖、分化、凋亡、免疫、炎症等一系列细胞活动的信号转导[4- 6]。

中枢敏化和外周敏化

中枢敏化在疼痛的传输过程中，脊髓依赖局部兴奋或者抑制性中间神经元、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体的激活、脑干的下行传导系统等机制调控疼痛信号的输出。在急性高强度的C纤维刺激、外周神经损伤和炎症的作用下，这些调节机制会发生转变，使得脊髓对外界刺激的反应性增高，进而导致中枢敏化[7]。涉及的机制主要包括NMDA受体的激活和5-羟色胺3(5-hydroxytryptamine 3，5-HT3)受体的激活。

外周敏化外周敏化是一种刺激物引发的伤害性感受器重塑[8]。受损细胞或者炎症细胞释放各种炎性介质，使得损伤和炎症部位的伤害性感受器功能发生改变，原本不足以引发或者不能引发伤害性信号传导的刺激就可以产生疼痛的信号传导，产生痛觉。致敏物质包括白细胞介素- 1(interleukin- 1，IL- 1)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、H+、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、CC趋化因子配体3(CC chemokine ligands 3，CCL3)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)等，这些物质与其受体或者伤害性感受器结合激活下游的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)和ERK等信号，主要使瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)通道和电压门控钠离子通道受体发生磷酸化，导致外周敏化。

MAPKs信号通路与DNP

MAPKs信号在疼痛的发生和发展中有着重要的作用。最新研究表明，PKC/ERK信号通路和下游信号的激活是疼痛发生和巩固的必要条件[9]，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)1/c-Jun复合体通过JNK信号通路促进神经损伤导致的神经病理性疼痛的发生[10]，p38参与的炎性信号通路是骨癌痛发生的机制之一[11- 12]。在以DNP为模型的研究中，研究人员发现MAPKs在脊髓和脊髓背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)中都呈激活状态，在不同的模型和不同的组织中，其细胞定位也不相同。在功能上，ERK激活后可以通过激活下游环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、NMDA等信号导致DNP；p38主要通过上调DRG中疼痛相关离子通道蛋白以及炎症因子的表达来引发DNP；JNK则通过与NMDA、单核细胞趋化蛋白- 1(monocyte chemotactic protein- 1，MCP- 1)相互作用来参与DNP的发生。研究发现，一些临床药物和新发现的活性物质都能以上述机制为靶点，来缓解DNP中枢和外周敏化的症状。

ERK与DNPERK1是哺乳动物MAPK家族中第1个被鉴定出来的成员。生长因子、细胞因子、渗透压的变化、G蛋白偶联受体的配体都可以通过Raf/MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)/ERK通路激活ERK，引发下游生物学效应。

中枢敏化：ERK的激活是DNP中枢敏化的机制之一。1型糖尿病大鼠腰段脊髓背角中ERK1和ERK2的mRNA和蛋白表达量都显著上升，其中，ERK1和ERK2蛋白的表达量呈时间依赖性，在注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)后3周达到高峰，鞘内注射MEK抑制剂PD 198306可以使疼痛得到缓解[13]，另一项研究用鞘内注射另一种ERK抑制剂U0126的方法验证了ERK的磷酸化程度与疼痛呈正相关[14]。

活化的ERK在不同DNP模型中表达在不同的细胞中。在1型糖尿病大鼠DNP模型中，磷酸化的ERK1/2主要表达在脊髓背角的神经元及小胶质细胞中，而星形胶质细胞中却无表达[14]。另一篇研究的荧光共染结果则没有发现神经元中磷酸化ERK的表达[15]，因此，磷酸化ERK是否在神经元中表达存在一定争议。在小鼠2型糖尿病模型中，ERK在脊髓背角中的激活主要发生于星形胶质细胞中，神经元细胞中也有少量激活，而在小胶质细胞中没有明显激活[16]。

ERK激活后可以通过影响其他蛋白的变化来产生下游生物学效应。1型糖尿病大鼠脊髓背角中神经元和小胶质细胞中的磷酸化ERK可以使NMDA受体的NR1亚基发生磷酸化，进而导致痛阈的下降[17]。在大鼠2型糖尿病模型中，脊髓背角中ERK、CREB和NMDA受体NR2B亚基的磷酸化水平与DNP的发生显著相关[18- 19]，姜黄素可以抑制脊髓背角中ERK和CREB的磷酸化来缓解DNP症状[20]。

外周敏化：ERK在DNP外周敏化中的机制研究较少。Daulhac等[14]研究发现，在1型糖尿病大鼠DNP模型中，DRG中磷酸化ERK1/2的表达量呈显著上升趋势，但他们并没有指出在哪些类型细胞中表达增高。Dang等[18]研究结果显示，在大鼠2型糖尿病模型中，DRG中的ERK和CREB磷酸化水与DNP的发生显著相关。有研究提出，姜黄素也可以通过抑制DRG中ERK和CREB的激活来缓解DNP[20]。

p38与DNPp38α于1994年首先被发现，随后p38β、p38γ和p38δ也相继被鉴定出来。由于p38α表达量显著高于其他亚型，所以绝大多数文献中的p38 MAPK指的是p38α。当细胞受到应激和炎症因子刺激时，p38会被显著激活，在免疫、炎症、细胞增殖等方面发挥重要作用。

中枢敏化：脊髓中p38的磷酸化也是DNP发生的机制之一。研究发现，DNP模型脊髓背角中磷酸化p38显著增加[14，21]。Sweitzer等[22]研究发现，单次或连续6 d给予p38抑制剂SD- 282都可以提升1型糖尿病大鼠的机械痛阈，对于热痛阈来说，SD- 282可以阻止C纤维介导的热痛阈降低，但对Aδ纤维介导的热痛阈下降没有影响。

p38的激活存在于小胶质细胞[23]和神经细胞中[14]，并且是一种慢性过程。研究表明，STZ诱导的大鼠1型糖尿病造模后1周至6个月，p38在脊髓背角中的小胶质细胞中持续发生显著激活，并且伴随着神经元数量的显著减少[23]。

某些干预措施可以通过影响脊髓背角中p38的激活来缓解DNP症状。柯昌斌等[24]研究结果显示，腹腔给予DNP大鼠NMDA拮抗剂MK- 801可以显著抑制脊髓中p38磷酸化和NR1 mRNA表达量上调，进而缓解DNP症状，可见NMDA是p38的上游分子之一。除了基础科研用的抑制剂外，腹腔给予氯胺酮能够抑制脊髓中p38磷酸化来提升DNP大鼠痛阈[25]。持续腹腔给予临床常用药物利多卡因可以抑制1型糖尿病小鼠脊髓背角小胶质细胞中p38的激活[26]，大麻素也有相似的效果和变化，其机制可能由大麻素受体2介导[27]。米诺环素可以显著降低脊髓背角中p38磷酸化、小胶质细胞激活及TNF-α、IL- 1β和iNOS的表达量，进而缓解DNP[28]。国内少量关于传统医学针灸刺激的研究结果显示，电针刺激DNP大鼠足底可以降低脊髓中p38磷酸化水平，进而缓解疼痛[29- 30]。

外周敏化：有研究显示，DNP大鼠DRG中的磷酸化p38显著增加[24，31]。在1型糖尿病大鼠DNP模型中，p38并未在DRG中的小胶质细胞中激活，p38在DRG中激活细胞的定位也尚不清楚[32]。在2型糖尿病小鼠的DRG中，p38持续激活至少10周，在第8周达最高峰，经免疫荧光证实，p38激活主要在神经元中，其激活可能由NGF介导[33]。

p38的激活与疼痛相关离子通道蛋白表达的变化密切相关。Pabbidi等[34]发现，1型糖尿病小鼠DRG中瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)蛋白表达量和p38的激活量都呈上升趋势，他们在体外细胞实验中发现，给予p38抑制剂SB203580后，TRPV1蛋白的表达量显著下降。可见，DNP小鼠热痛阈的下降可能与DRG中激活的p38上调了TRPV1蛋白有关。Chattopadhyay等[35]研究结果显示，给DNP大鼠接种能表达脑啡肽的质粒后，大鼠的机械痛、热痛、冷痛阈值都得到一定程度的回升，其主要机制可能是通过抑制PKC激活来抑制p38激活，进而下调DRG神经元Nav1.7的表达。

p38激活可以介导炎症反应，是DNP发生的主要原因之一，通过影响p38的磷酸化水平可以缓解DNP症状。研究显示，在2型糖尿病小鼠的DRG中，iNOS、COX- 2和TNF-α显著增加，给予p38抑制剂后，糖尿病小鼠的痛阈得到回升，DRG中炎性相关分子(iNOS、COX- 2和TNF-α)显著下降，这些炎症蛋白的变化主要发生在DRG神经元中[33]。Khan等[36]研究发现，一种新型药物anomalin可以缓解DNP小鼠的机械痛阈下降，抑制硝普钠诱发的 N2a细胞中p38磷酸化，降低暴露于高糖环境的DRG原代神经元中TNF-α、IL- 1β、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和CCL- 2 mRNA的表达量。在原代培养的小胶质细胞中，利多卡因可以显著抑制小胶质细胞中p38磷酸化和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)导致的炎性因子释放[26]。

中和炎性因子以及促进炎症消退的策略在DNP模型中也取得一定疗效。给DNP大鼠模型接种可溶性TNFα受体或IL- 10载体都可以通过影响p38的磷酸化和炎性因子释放来缓解DNP症状[31，37]。体外实验证明，Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)拮抗剂可以显著降低高糖环境下DRG神经元磷酸化p38、TNF-α及热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)的表达[37]。

JNK与DNPJNK与p38 MAPK相似，在热休克、电离辐射、氧化应激、DNA损伤等细胞应激状态下激活，其主要功能与细胞增殖或者凋亡有关。

中枢敏化：DNP大鼠脊髓中的JNK也呈显著激活状态[14，38]，主要发生在神经元细胞和小胶质细胞中[14]。鞘内注射JNK抑制剂SP600125可以使机械痛阈显著回升。

JNK的激活处于通路的中间环节。给予NMDA受体抑制剂后，JNK的磷酸化程度显著降低，DNP大鼠的痛阈也得到回升，说明NMDA的激活是JNK激活的上游[14]。郑昌健等[39]研究发现，JNK/MCP- 1在DNP的发生中起到了重要的作用，抑制JNK激活可以显著缓解DNP，加入MCP- 1激动剂可以逆转这一效果，但不能促进JNK磷酸化，说明MCP- 1是JNK激活的下游分子。

目前关于通过抑制中枢JNK激活来抑制中枢敏化的研究较少。仅有国内一篇研究报道，姜黄素可以呈剂量依赖性抑制DNP大鼠脊髓背角中的JNK和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)磷酸化[40]。

外周敏化：DNP大鼠DRG伤害性感受神经元和坐骨神经轴突中的磷酸化JNK显著增高，给糖尿病大鼠非达司他处理后，上述变化得到一定缓解[41]。姜黄素可以呈剂量依赖性地抑制DNP大鼠DRG中JNK和NF-κB的磷酸化[40]；加巴喷丁能显著降低DRG中、小神经元中JNK的激活，进而缓解大鼠DNP的症状[42]。

总 结

近年研究结果已经充分显示，DNP与脊髓、DRG和坐骨神经中MAPKs的过度激活密切相关，抑制上述MAPKs的过度激活可以显著缓解DNP的疼痛症状。然而，目前干预措施主要在动物水平，缺乏高质量的临床研究。随着现代分子生物学技术和药物研发的不断进步，相信会有以过度激活的MAPKs为靶点、能够显著改善DNP症状的药物进入临床，提高DNP人群的生活质量。