缺血性脑血管病的现代研究进展

张业昊，姚明江，刘建勋

(中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京 100091)

脑卒中是一种常见的疾病，绝大多数脑卒中病例是由短暂性或永久性脑血管闭塞引起的缺血性脑血管病(缺血性中风)，最终导致脑梗死。最终的梗死面积和神经系统结局取决于多种因素，如缺血的持续时间和严重程度、侧支系统的存在和足够的全身血压、梗死的病因和定位、患者年龄、性别等。因此，缺血性中风是一种高度复杂和异质性的疾病。中风的长期表现可以包括抑郁症、中风后疲劳、痉挛状态和全身功能丧失，最终导致血管性认知障碍。虽然中风是一种复杂的疾病，但一些常见的特征可以用实验性中风来模拟。缺血性中风的一个重要组成部分是不断变化的脑损伤，这是由半影的概念所解释的。在几分钟内，血液供应在基线水平下降15%～20%时，会导致梗死核心不可逆转地受损，并伴有快速坏死性细胞死亡。在周围的脑组织中，血流量减少的幅度减小，导致神经元功能丧失，同时维持结构完整性。如果没有血流恢复，这个所谓的有风险的组织将被纳入梗死核心。电活动丧失和不可逆神经元去极化之间的脑灌注范围，被称为半暗带[1]。在临床试验中，已经研究了许多策略来改善缺血性中风的脑部抢救和恢复，包括抗氧化策略、神经元保护策略，甚至是抗炎策略。尽管进行了大量的临床试验，但由于潜在的不同原因，这些缺血性卒中治疗药物大多数都失败了，包括所研究患者的变异性和复杂性、脱靶效应、效力不足或临床前模型不足。尽管一些药物已经显示出初步的希望，而其他药物仍处于临床试验阶段。因此，探究缺血性中风的病理机制及寻找有效的药物，是目前亟需解决的问题。

1 缺血性中风与代谢组学的关系

代谢组学是基于特定生物或细胞中终产物的定性和定量分析[2]。1970年，Horning等[3]开始研究代谢物在人体内的代谢谱。1983年，尿样首次通过气相色谱-质谱(GC-MS)进行分析。代谢组学研究可以通过揭示代谢网络和生物标志物，阐明特定的机制。与单独的单一途径或单一生物标志物相比，系统性数据更有助于阐明复杂疾病，如脑缺血的发病机制[4]。迄今为止，脑缺血的发病机制与能量代谢、兴奋性氨基酸毒性、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和炎症反应有关。这些过程涉及多种代谢物，其定性和定量表达是代谢组学的重点。

常用于脑缺血代谢组学研究的动物包括大鼠、小鼠、沙鼠、兔、狗、猫、猴和猪，其中，大鼠最常使用。迄今为止的研究发现，大鼠脑缺血后的代谢产物主要分为以下5类：氨基酸、核酸、神经递质、脂质和有机酸。样品包括血浆、血清、皮层、海马、纹状体、丘脑、中脑、白质、松果体和嗅球。在这些组织中，血浆、血清、脑脊液、皮层、海马和纹状体得到较好的研究，而其余的样本研究较少。氨基酸类是最常被发现的变化的代谢产物，研究发现，兴奋性氨基酸(excitatory amino acid,EAA)，包括谷氨酸和天门冬氨酸在缺血/再灌注后的1 h内明显增加[5-6]。Wang等[7]在缺血/再灌注后24 h观察到血清和脑脊液中谷氨酸水平增加，而其他氨基酸如丙氨酸，动态降低然后增加。脑脊液中甘氨酸和丝氨酸的水平在缺血后6 h内持续下降。然而，并非所有的实验都表明缺血/再灌注后EAA增加。目前研究已发现20多种在脑缺血模型中发生变化的核酸代谢产物，Irie等[8]使用LC-MS和基质辅助激光解吸/电离-MS(MALDI-MS)技术，检测再灌注后大鼠皮质、海马和纹状体中的20种核酸，并将结果与正常半球进行比较。在皮层和纹状体中，大部分核酸水平发生明显变化，而海马中的水平保持不变。大多数核酸在再灌注后的很长时间内不断减少。已经提出了两种理论来解释这些下降：首先，在缺血早期，EAA的强大合成过程迅速耗尽了核酸库；其次，参与戊糖磷酸途径的核糖-5-磷酸脱氢酶的活性在局部缺血时降低，从而降低总核酸水平[9]。

在早期脑缺血研究中，研究人员通常会制备全脑组织匀浆，这些研究的结果显示了全脑代谢物的平均水平。然而，在不同脑区个别代谢物的表达是不同的。例如，Macrì等[10]发现，海马体中丙氨酸水平降低，但在皮质中保持稳定。因此，在脑缺血代谢组学研究中，样本应限制在特定的脑区，以确保识别的生物标记物的准确性。

2 缺血性中风与microRNA的关系

miRNA是小的非蛋白质编码RNA，其包括通过进化高度保守的20～24个核苷酸。它们是转录后调节剂，靶向mRNA的3′非翻译区(3′-UTRs)，抑制各自mRNA的翻译或降解[11]。miRNA已牵涉多种细胞过程和疾病，如神经元发育、分化、突触可塑性、增殖、代谢、凋亡、神经变性疾病和肿瘤的调控。miRNA几乎在大脑功能的各个方面发挥重要作用，包括神经发生、神经发育和导致突触可塑性变化的细胞反应。它们还涉及神经变性和神经疾病，对缺氧和局部缺血的应答以及缺血预处理诱导的缺血耐受。在最近的研究中，已经在临床试验和动物实验分别筛查miRNA表达谱，这些研究表明，miRNA已经成为缺血性中风生物学中的关键介质。

2.1 microRNA与缺血性兴奋性毒性缺血性中风主要通过兴奋性中毒损伤脑组织，脑缺血后，突触间的谷氨酸大量释放，诱导细胞死亡。谷氨酸是中枢神经系统(central nervous system，CNS)中的主要兴奋性神经递质。在缺血性中风后，miR-107的过表达，导致抑制谷氨酸转运蛋白-1(glutamate transporter 1，GLT-1)表达和谷氨酸蓄积增加，这决定了兴奋性毒性的程度[12]。GLT-1缺血后的下调与谷氨酸的积累密切相关，提示谷氨酸积累和神经元兴奋性中毒可通过GLT-1表达来控制[13]。在短暂的前脑缺血后，增加miR-29a保护星形胶质细胞，进而保护神经元。miR-29a导致PUMA(上调凋亡调节剂p53)水平下降，从而抑制星形胶质细胞GLT-1，导致氧化应激减弱和神经元存活[14]。通过抑制谷氨酸受体2(glutamate receptor 2，GluR2)和天冬氨酸(N Methyl D Aspartate，NMDA)亚基NR2B的水平，miR-223的过度表达，减弱了海马神经元中NMDA诱导的钙内流，并且保护缺血性脑免受兴奋性中毒神经元细胞死亡[15]。据报道，NR2A是miR-125b的靶标，miR-125b负向调节NR2A的表达[16]。被NR2B激活的NMDA受体导致兴奋性中毒和细胞凋亡，而含有NR2A的NMDA受体的激活，会发挥神经保护作用，并促进神经元对抗兴奋性毒性介导的神经元损伤。受NMDA受体亚单位影响的突触可塑性发生改变，这是一种破坏性的影响，中风损伤后可塑性能促进成体脑复苏[17, 18]。

2.2 microRNA与缺血性氧化应激氧化应激是由体内的活性氧/氮物质增加，以及抗氧化应激防御系统的减少引起的。缺血期间脑内会产生大量活性氧和自由基，形成的原因主要有兴奋性毒性谷氨酸的高刺激、钙超载、线粒体功能障碍、神经元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)的激活，以及炎症细胞的迁移产生的过氧化物阴离子。氧化损伤是缺血性中风期间脑损伤和神经元细胞死亡的基本机制。由于高氧环境，大量过氧化脂质和低抗氧化剂的产生，大脑最终受到进一步损伤。

核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶-1(haem oxygenase 1，HO-1)通路是抵抗局部缺血/再灌注引起的氧化应激的重要细胞防御机制。已有的研究显示，miRNA参与Nrf2水平的转录后调节。研究表明，miR-424降低了丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平、ROS，消除了H2O2诱导的神经元损伤，从而起到神经保护作用，以抵抗缺血性氧化损伤[19]。评估miR-93在脑缺血损伤中的作用表明，miR-93直接与Nrf2基因预测的3′-UTR靶位点结合，然后减弱Nrf2和HO-1的表达[20]，另外Nrf2的增加导致SOD上调[21]。在脑缺血期间，环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)可以产生ROS，COX-2是miR-101的靶标基因[16]。在正常情况下，COX-2低表达，而研究表明，脑缺血易于诱导神经元细胞中的COX-2高表达[22]，而脑缺血中miR-101表达下调。此外，还发现miR-146a抑制COX-2在神经系统疾病中的表达[23]。因此，miRNA可被认为是拮抗缺血性中风氧化应激的有价值的治疗手段。

缺血性卒中后，miRNA功能的失调、改变，对参与缺血过程的下游靶基因有深远的影响。单个miRNA主要通过抑制和激活许多下游mRNA靶点，来发挥其细胞功能。miRNA表达的变化与缺血后致病过程，如兴奋性中毒、炎症、氧化应激和细胞凋亡之间，都有紧密的联系。miRNA谱提供的证据表明，它们的改变可能有益于缺血性卒中诊断，并且是潜在的治疗靶点。此外，miRNAs调节众多靶基因的能力清楚地表明它们在缺血性中风治疗中的重要性。

3 缺血性中风与炎症的关系

炎症和免疫反应已经成为卒中发病和发展的重要因素。中风过程中的免疫炎症反应开始于脑及其血管内。脑缺血或直接、间接的脑出血，迅速诱发原发性不可逆组织损伤。辅助过程，如兴奋性毒性、氧化应激和线粒体紊乱，将这种损伤扩大到部分保留的梗死周围区域(半暗区)。对这些事件做出反应的第一批免疫细胞似乎是脑内固有的小胶质细胞，随后是从外周通过血脑屏障的内皮细胞管壁进入大脑的白细胞[24]。这些白细胞的进入可能是由来自垂死神经元的趋化因子引导的。内源性损伤相关分子模式分子也从死亡细胞释放，并且有利于炎性介质的上调[25]。中枢神经系统具有丰富的神经上皮来源的常驻细胞，这些细胞被归类为神经胶质细胞。神经胶质细胞亚型包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和多形核细胞。最近的研究表明，神经胶质细胞不是简单的被动支持细胞，相反，它们积极与神经元和类似缺血性脑卒中应激条件下其他CNS细胞相互作用[26]。星形胶质细胞是“神经血管单元”的基本要素，神经血管单元主要包含内皮细胞、神经元、星形细胞终末足细胞，甚至周细胞。在CNS中最多类型的神经胶质细胞是星形胶质细胞，其存在于白质(例如胼体)和灰质(例如皮质)，并且表征为先天性免疫神经胶质细胞。星形胶质细胞作为先天性神经免疫的哨兵，参与调节突触活动，调节体内水平衡以及清除有毒代谢物[27]。中枢神经系统缺血后，星形胶质细胞经过许多变化，包括快速膨胀、提高的Ca2+信号传导、GFAP的表达(所有反应性星形胶质细胞增生的标志)增加[28]。延长激活后，反应性星形胶质细胞将形成神经胶质瘢痕。除了这些形态改变，星形胶质细胞积极地通过产生炎症介质(IL-6、IL-1β)、补体成分和趋化因子(CXCL12、CXCL1、CXCL10、MCP-1)，延续CNS缺血性免疫应答[29]。

因此，缺血后炎症的发生，在脑缺血损伤的各个阶段中起重要作用。在缺血性中风治疗中使用抗炎策略具有一定的前景，并且由于星形胶质细胞是CNS中最丰富的细胞亚型，它们在结构和功能上，参与正常脑生理学和缺血性病理学反应。它们积极与所有类型的脑细胞进行接触和交流。因此，星形胶质细胞在脑功能和生理学中起着重要的支持和调节作用。中风后，星形胶质细胞炎症反应可能加剧急性期的缺血性损害，而梗死周围区域的胶质瘢痕可能阻碍轴突再生，并随后减少急性期后的功能结局。

4 展望

对于缺血性中风的研究，仍然有必要从多角度、多靶点寻找治疗手段。一方面，缺血性中风主要是一种简单且明确的病理状态，伴随着血流中断和依赖组织的连续损伤；另一方面，缺血性卒中是一种非常复杂和异质性的疾病，其在临床表现上除了神经系统定位症状和体征外，还伴有一系列的神经心理症状和精神行为异常。严格地说，中风不是单一的神经系统疾病，而是潜在的系统性问题的表现，如动脉粥样硬化、炎症或感染，这可能在其他器官中引起梗死，例如心脏病的发作。因此，任何针对单一环节的治疗都不足以应对这一系列的问题。复方中药已在中国和一些亚洲国家应用了几千年，过去几十年的研究揭示了复方中药治疗复杂疾病的优势[30]，其含有多种具有潜在功能的生物活性成分，包括调节能量代谢、抗氧化、抑制炎症因子释放、抗血小板聚集等，并对血栓形成、白蛋白渗漏和肥大细胞的脱颗粒等都具有一定的抑制作用。未来探索复方中药治疗缺血性中风，必然显现出多靶点、多途径的治疗优势。