基于D-半乳糖致衰老鼠模型的抗衰老药物研究进展

曾立，向荣

(1.邵阳学院 药学院，湖南 邵阳,422000；2.邵阳学院 附属第二医院放射科，湖南 邵阳,422000)

衰老是指在正常状况下发育成熟的生物体，随着年龄的增加，机体内环境稳定能力和应激能力下降导致结构、功能逐步发生退行性变化，且不可逆转的自然过程[1]。因此，在遵循自然规律的前提下，延缓衰老、减少衰老相关疾病的发生是缓解当今老龄化社会一系列问题的关键。建立合适的动物衰老模型，筛选出高效低毒的抗衰老药物并探讨抗衰老机制是当前抗衰老研究热点。

从最简单的单细胞到复杂的灵长类动物，人类尝试从不同层次的生物衰老模型中探索衰老的奥秘，并尝试是否可从中筛选出一些能延缓衰老的药物。酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、老鼠、猴等多种生物都曾被用来作为衰老模型的重要工具，但各种生物衰老模型都有自身的缺陷。文献检索表明，D-半乳糖致衰老鼠模型的生化和生理指标均与自然衰老相似，同时该模型具有操作简单、实验结果稳定且效果明显的特点，现已成为国内外公认的经典衰老模型[2-5]。文中以“D-galactose aging”为主题，分别在Web of Science、百度学术和中国知网等学术网站检索了近年来基于D-半乳糖致衰老鼠模型的相关药物在抗衰老研究中的进展，为实现全民健康衰老提供参考。

1 D-半乳糖致老鼠衰老模型的机制

关于衰老的学说有很多，其中最著名的氧化应激学说认为:衰老早期阶段，低剂量的活性氧能够激发机体保护性的压力应激反应，延缓衰老；当年龄增加，衰老相关的氧化损伤在体内持续聚集，超过了机体的清除能力，这些蓄积的活性氧加剧与衰老相关的DNA损伤，加速细胞的衰老[6]。D-半乳糖致老鼠衰老模型的建立以该学说为基础，其中D-半乳糖诱导产生过氧化应激是导致老鼠寿命缩短的主要原因。D-半乳糖是体内自然存在的一种还原醛糖，正常情况下可代谢为葡萄糖。大量研究表明，长期注射D-半乳糖溶液的老鼠机体内会产生过量的活性氧(ROS)，持续增强的氧化应激使各器官抗氧化酶的活性降低[4]。当机体无法维持机体内氧化还原平衡时，ROS则会诱导相关的细胞信号转导通路，导致器官免疫功能退化而不断分泌促炎因子，机体组织细胞出现程序性坏死或凋亡，线粒体功能失常，最终导致出现以机体功能衰退为特征的衰老症状[7],见图1。

图1 D-半乳糖致老鼠衰老的机制Fig.1 Mechanism of aging induced by D-galactose in mice

2 基于D-半乳糖致衰老鼠模型的天然产物抗衰老研究

天然产物的来源包括植物、动物和微生物等。因为天然产物副作用小，结构多样且活性丰富，一直以来都是药学科研工作者筛选活性成分的首选对象[8]。基于D-半乳糖致老鼠衰老模型研究抗衰老功能的天然产物报道较多，不仅有结构各异的单体化合物，还包括天然产物的提取物以及中成药。

2.1生物碱类

生物碱结构复杂，大多具有显著生理活性。Ruan等研究表明，石杉碱甲可显著抑制D-半乳糖诱导(DG,下同)模型大鼠海马中乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的增加，而且可通过抑制核因子κB(NF-κB)活化，改善海马区因炎性损伤导致的神经血管损伤、血脑屏障的功能障碍、紧密连接密度以及细胞凋亡，延缓脑衰老[9]。顾健等报道了石杉碱甲可抑制DG老年性聋大鼠的耳蜗组织内的施万细胞的激活和NF-κB活化，进而抑制炎症因子的释放，起到局部抗炎作用[10]。李聪等通过β-半乳糖苷酶染色发现模型鼠耳蜗衰老细胞密度最高，采用石杉碱甲治疗后神经纤维的数目和对照组无明显差异，而模型组神经纤维数目明显少于治疗组，表明石杉碱甲对老年性聋的神经纤维具有保护作用[11]。Xian研究了异钩藤碱不仅可降低DG小鼠脑组织丙二醛(MDA)的水平，还可增加超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力，提高谷胱甘肽(GSH)的水平。同时，异钩藤碱还可抑制前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮(NO)的含量，降低环氧合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达，抑制NF-κB的蛋白表达，改善DG小鼠的空间学习记忆功能[12]。Ullah采用免疫荧光检测，发现咖啡因可通过减少8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-d G)降低氧化应激，抑制氨基末端激酶的磷酸化(p-JNK)表达，改善DG大鼠记忆障碍和突触标志物(突触泡蛋白和突触后致密蛋白95)表达。同时咖啡因可通过减轻COX-2、iNOS、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白表达，降低了神经炎症；通过减少细胞色素C(cyt c)、Bax/Bcl-2比值、半胱天冬酶-9(caspase-9)、半胱天冬酶-3(caspase-3)和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶-1(PARP-1)蛋白表达水平，防止神经性退行性疾病[13]。Fu研究了岩黄连碱可减少脂质过氧化物(LPO)含量，恢复抗氧化酶活性，从而降低氧化损伤和神经炎症，减轻DG大鼠学习记忆障碍[14]。

2.2 酚类

结构上含有酚羟基的化合物可以统称为酚类化合物，这类化合物通常具有良好的抗氧化活性。芙蓉李总多酚提取物可以显著增强DG小鼠血清SOD活力，降低MDA含量，显著增强肝、脑组织SOD、GSH-Px活力，降低MDA含量，从而提高机体抗氧化能力延缓衰老[15]。Xu等通过观察模型鼠苏木精-伊红染色肾切片，结合血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的水平，发现了木犀草素可显著抑制DG小鼠肾脏中的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化，减弱D-gal诱导的氧化损伤并抑制炎症反应[16]。研究表明，姜黄素比橙皮苷更能有效减少DG大鼠氧化脂质水平，caspase-3蛋白表达和线粒体酶的水平。二者联合用药可降低caspase-3表达和MDA含量，改善线粒体酶和GSH的蛋白表达，提高神经元的生物化学功能，从而改善认知[17]。不同剂量的原花青素可降低DG小鼠脑组织MDA和NO的水平，β淀粉样蛋白(Aβ1-42)的含量，在降低乙酰胆碱(ACh)、单胺氧化酶B(MAO-B)、一氧化氮合酶(NOS)和神经型一氧化氮合酶(nNOS)活性的同时增加SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，提升机体抗氧化能力。同时，原花青素还可降低海马区p53蛋白的表达，保护神经元不受损伤，改善DG小鼠的学习和记忆能力[18]。花青素可降低促进糖基化终产物受体(RAGE)的表达，ROS水平和脂质过氧化物水平，维持体内氧化还原平衡。同时可通过抑制海马和皮质中的p-NF-κB、iNOS和TNF-α等各种炎症标志物的蛋白表达来抑制DG大鼠脑组织神经炎症；通过抑制p-JNK和改善突触蛋白(包括突触泡蛋白，突触体相关蛋白SNAP-23、SNAP-25和磷酸化CREB)失调，防止神经细胞凋亡[19]。乙酰紫草素能降低IL-1β、TNF-α、MDA的水平和增强SOD的活性，改善D-gal引起的氧化应激和神经炎症，通过sirt1/p53/p21途径预防大脑老化[20]。

2.3 糖与苷类

糖以及糖与非糖物质结合形成的苷结构各异，活性千变万化。枸杞多糖可显著降低Aβ1-42的含量和沉积，改善突触可塑性的功能障碍，增加ACh的水平，减少DG小鼠氧化应激并抑制炎症反应[21]。樊艳玲等研究发现，模型鼠采用当归多糖治疗后，血清中的BUN、Cr、晚期糖基化产物(AGEs)和8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷(8-OH-dG)含量显著下降，肾小球数目增多，硬化肾小球减少，肾小囊腔与肾小管管腔扩张不明显，SOD与GSH-PX活性显著增加，MDA含量下降，显示出当归多糖具有抗肾衰老作用[22]。Hu等研究发现，人参皂苷Rg1可降低模型鼠骨组织MDA水平，同时显著降低IL-2、 IL-6、TNF-α等炎症因子和衰老相关蛋白(p16,p21,p53)的表达水平，且显著升高SOD活性，通过增强骨髓基质细胞(BMSCs)的抗氧化和抗炎能力，提高骨组织造血微环境的抗衰老能力[23]。实验结果显示，模型鼠经人参皂苷Rg1治疗后，其肾脏MDA、脂褐素、转化生长因子-β1(TGFβ1)、纤连蛋白(FN)的含量均显著降低，SOD活性显著提高，说明该药物对模型小鼠肾具有一定的保护作用[24]。毛蕊花糖苷的致衰老鼠实验表明，该药物可调节脑组织胆碱乙酰转移酶(ChAT)和AChE活性，保护脑组织海马CA1区神经元细胞不受损，提高脑组织和免疫器官指数，明显改善衰老小鼠的学习记忆能力障碍[25]。王国勇等研究发现DG小鼠血清、脑组织SOD活性显著下降，MDA含量显著上升；胸腺T细胞CD3+、CD3+CD45RA+、CD3+CD28+、CD3+CD25+表达下降，CD3+PD-1+表达上升；脾T细胞CD3+CD45RA+、CD3+CD25+呈下降趋势，CD3+CD25+Foxp3+表达上升。而类叶升麻苷干预治疗后，能够显著提升血清、脑组织SOD活力，降低MDA含量，有效恢复胸腺、脾T细胞抗原表达水平，改善免疫功能，维持神经元细胞的正常功能[26]。结合Morris水迷宫测试，实验结果表明，积雪草苷能通过调节DG小鼠脑组织MDA、NO、nNOS、SOD、 GPX、GSH等的水平或活力，减少氧化损伤，并通过下调NF-κB和蛋白激酶(ERK)/p38 MAPK信号通路抑制TNF-α、IL-1β表达，改善海马突触可塑性相关蛋白(PSD-95,p-NMDAR1,p-CaMKII,p-PKACβ,PKCγ,p-CREB,BDNF)的表达，降低胆碱酯酶(AChE)活性，增加乙酰胆碱(ACh)的水平，改善其记忆障碍[27]。Gao等研究了红景天苷可通过SIRT1/NF-κB 通路抑制D-半乳糖引发大鼠炎性反应和记忆障碍[28]。Li等的实验表明远志皂苷B可以通过提升衰老大鼠的抗氧化和抗炎能力来促进认知能力的恢复[29]。

2.4 内酯

双白术内酯可通过降低ROS以降低AChE活性，增加治疗组小鼠突触蛋白I和蛋白激酶C(PKC)的表达，改善DG小鼠在被动回避试验和空间学习记忆试验中的行为表现。该药物改善老化记忆障碍的可能机制为(i)通过降低ROS形成来减弱氧化损伤；(ii)通过降低AChE活性恢复胆碱能神经传递；(iii)增加记忆相关蛋白(突触蛋白I和PKC)表达[30]。藁本内酯可通过降低脑组织中MDA水平以及增加Na+-K+-ATPase活性，改善老化小鼠的行为表现。同时可提高模型小鼠大脑内与神经发育和再生相关的轴突膜蛋白GAP-43的表达，降低caspase-3和神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达水平，保护神经元细胞[31]。秦皮甲素能抑制DG大鼠血糖水平以及晶状体组织中MDA含量、醛糖还原酶(AR)活性，显著增高晶状体GSH水平，预防晶状体衰老损伤[32]。

2.5 氨基酸与多肽

肌肽和牛磺酸可降低衰老大鼠脑组织中MDA水平以及AChE活性，增加GSH水平以及SOD和GSH-Px的活性，其中肌肽增加SOD和GSH-Px的活性尤为明显，二者都可改善模型大鼠脑组织病理状况[33]。核桃多肽可提高DG小鼠大脑总抗氧化能力(T-AOC)和SOD活性，降低MDA含量，同时降低血脂中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量[34]。补充大豆多肽可以显著提高模型组大鼠骨骼肌SOD活力以及SOD/MDA比值，提高血清生长激素(GH)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)含量和骨骼肌IGF-I mRNA表达量，降低骨骼肌丙二醛(MDA)含量，有效缓解骨骼肌衰老进程[35]。

2.6 来源于天然产物的中成药

近年来，随着人类疾病谱的改变、人口老龄化以及“回归自然”的思潮影响，一度踌躇不前的中药得到越来越广泛的关注和应用。五鹤续断注射液可降低模型小鼠脑组织MAD与LPO含量，提高了SOD与GSH-Px的活性，且小鼠血清中白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-6(IL-6)含量显著高于对照组和模型组，具有较好的抗衰老作用[36]。天珠散能降低D-半乳糖致拟痴呆小鼠参考记忆错误(RME)、工作记忆错误(WME)水平，提升学习记忆能力，减轻脑老化引起的海马组织CA1区神经元变性和尼氏小体丢失，起到保护神经细胞的作用[37]。逍遥散低、中、高剂量组均可提高D-半乳糖所致阿尔茨海默病模型小鼠记忆潜伏时间，降低错误次数，提高血清SOD、ChAT活性，降低了MDA含量和AchE活性，而记忆功能以及血清SOD、MDA、ChAT、AchE的改善皆以逍遥散高剂量组最为明显[38]。养血清脑颗粒可以降低模型小鼠脑组织NO和MDA水平以及AChE活性，提升SOD、CAT和GPx的活性，抑制脑组织NF-κB介导的炎症因子和caspase-3蛋白表达，减少海马组织神经细胞损伤，改善行为表现，预防衰老[39]。舒脑欣滴丸可减少DG大鼠在空间探索实验中的逃避潜伏期，增加穿越平台次数，显著增加了脑组织的SOD活性，减少MDA水平，降低大脑皮质GFAP的表达和海马CA1区Caspase-3的表达而实现抗脑衰老[40]。

2.7 其它天然产物

植物乳杆菌C29可逆转模型鼠脑组织脑源性神经营养因子(BDNF)和海马双皮质素(DCX)的表达，抑制cAMP反应元件结合蛋白(CREB)。同时，该药物还可降低衰老标记物p16和炎症标记物p-p65、p-FOXO3a、COX-2和iNOS的蛋白表达，改善D-半乳糖诱导引发的记忆障碍和炎症[41]。Caralluma tuberculata甲醇提取物可显著提高DG小鼠脑组织T-AOC、GSH-Px、SOD活性，脑啡肽酶(NEP)和β-分泌酶1(BACE1)表达，降低NO、MDA、Aβ1-42和早老素1(PS1)水平以及NOS的活性，增强模型小鼠在逐步被动、主动回避测试、孔板测试新增对象识别任务和Morris水迷宫中的学习和记忆能力[42]。五味子石油醚提取物可逆转模型组大鼠的SOD、CAT、T-AOC的活性，有选择性地维持大脑和血清中GSH、MDA和NO水平，改善DG大鼠的认知缺陷[43]。核桃油胶囊能显著增强模型小鼠脑组织T-AOC，增加血清和脑组织中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，改善氧化应激引起的病理损伤，显著上调血红素加氧酶1(HO-1)和Klotho蛋白的表达，下调iNOS的蛋白表达。同时，该药物能有效清除自由基，提高机体抗氧化能力，减轻氧化应激损伤，可开发为抗衰老食品[44]。 水飞蓟油可降低DG小鼠血清中TG和TC水平，提高了肝和脑中SOD、GSH-Px和T-AOC的活性，降低肝和脑中的MAO和MDA水平，提高老化小鼠肝脏和脑中Bcl-2的活性，并通过改善Na(+)-K(+)-ATP酶，Ca(2+)-Mg(2+)-ATP酶，膜电位(ΔΨm)的活性，显著减弱D-gal诱导的肝脏线粒体功能障碍和膜流动性[45]。研究表明，长期高脂饮食可能增强DG大鼠的氧化性肾损伤，而这种与年龄相关的肾损伤可通过灌喂红参提取液来抑制氧化损伤[46]。

3 基于D-半乳糖致衰老鼠模型的合成药物抗衰老研究

除天然产物外，人工合成药物在抗衰老方面也显示出良好的应用前景。培哚普利可降低DG小鼠海马中caspase-3和caspase-9活性，升高Bcl-2 / Bax比值，抑制海马中细胞凋亡，改善模型小鼠学习和记忆能力[47]。成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)能降低衰老模型小鼠脑组织ROS 、MDA和AGEs的含量，提高SOD、GPx、CAT和T-AOC的活性，且具有剂量依赖性。同时，FGF-21还可通过抑制IκBα降解和NF-κBp65核转运来抑制促炎因子TNF-α和IL-6的表达，显著改善DG小鼠在水迷宫中到达终点的时间，降低碰撞盲端的次数，延长小鼠跳台实验的潜伏期及降低错误次数。HE染色结果显示，衰老小鼠大脑海马区神经细胞受损情况得到明显改善[48]。四氢巴马汀可改善模型鼠氧化应激状态，逆转脑组织ACh水平和AChE异常活动，抑制NF-κB和GFAP的蛋白表达，防治DG大鼠的神经炎症和记忆障碍[49]。

4 小结与展望

衰老是一种以累积退化性损伤为特征的过程，最终导致有机体的死亡[50]。综合相关研究表明，过量ROS产生的自由基会通过氧化作用攻击机体内细胞膜、核酸、蛋白质、酶等生物大分子，导致细胞膜上不饱和脂肪酸脂质过氧化，核酸与蛋白质分子交联，DNA突变或复制异常，同时伴随着抗氧化酶的活性下降，最终导致机体功能的严重损害并最终导致衰老甚至死亡。相对于眼、肝、肾、骨等机体组织来说，大脑脂质含量高，抗氧化防御能力较弱，最容易受到氧化应激影响而出现衰老性病变，一直是抗衰老研究中的热门靶器官。研究发现，依据衰老的氧化应激学说理论，寻找到具有抗氧化作用的活性成分是延缓衰老、提高老年人生活质量的重要前提。而天然产物不仅资源丰富，副作用小，还是生物次生代谢物，生物利用率较高，通常具有较好的抗氧化能力，所以一直是筛选安全和合适的抗衰老药物的研究热点。此外，根据自然产物衍生物的片段，利用现代计算机辅助药物设计技术人工合成的一些化学药物，也具有较好的抗氧化活性，为防治衰老提供了新的选择。

目前，虽然已经在衰老的机制和防治方面取得一定的研究成果，但衰老的机制不是自由基氧化损伤学说能完全解释清楚[51-52]，还需综合多学科知识，发展新的研究技术和手段来探索衰老的本质，为抗衰老研究提供理论依据。首先，虽然老鼠是一个很好的实验模型，但与人还是有较大区别，建立更接近临床病理表现的动物模型(灵长类动物)阐明衰老机制是重中之重；另外，衰老是一个复杂的动态过程，涉及到多领域和多学科知识，建立一个系统化、可靠性强的研究方案至关重要；最后，结合代谢组学、基因组学和蛋白组学等分子生物学知识探讨衰老的机制，研究药物的抗衰老作用应该是研究的主要方向。总之，解决老龄人衰老性疾病发病是一项非常紧迫的任务，只有在基础和临床研究两方面同时着手，才可能筛选出安全有效的抗衰老药物。