醇浓度对黑木耳醇提物收率及三种活性成分含量的影响
2019-01-08孔祥辉马银鹏张介驰于德水王笑庸陈静宇
孔祥辉 丛 鹏 韩 冰 梁 霆 马银鹏张介驰* 于德水 陈 鹤 王笑庸 陈静宇
（1黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨150010；2黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨150001；3哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨150028）
黑木耳（Auricularia auricula）具有提高免疫力、抗血栓、抗辐射、抗溃疡、清胃涤肠[1]、延缓衰老[2]、抗菌[3]和降脂降压等活性。我国东北地区广泛栽培黑木耳，在“十三五”期间，黑木耳产业将大力持续发展[4]，深加工技术研究大有前景。目前，人们对黑木耳的药用研究主要集中在多糖、腺苷和黑色素等方面[5-7]，对黑木耳中黄酮类、多酚类化合物研究不多[8，9]，黄酮类以及作为第七类营养素的多酚类化合物具有强抗氧化能力，清除自由基，保护细胞作用[8]；蔡铭[10]等比较了黑木耳总黄酮和多酚提取率及抗氧化能力；张丕奇[8]等测定了用沙棘废渣栽培的黑木耳中的总黄酮含量。三萜类化合物有止痛、保肝、毒杀肿瘤、镇静、解毒等药理活性[11]，而关于黑木耳三萜类成分研究尚未见报道。研究分析黑木耳不同醇溶液的提取物，确定最佳醇提浓度和醇提物中总黄酮、多酚和三萜类化合物含量，并对提取后多糖和黑色素残渣（Residues removed polysaccharides and melanin，RRPM）进行醇提及活性成分分析，为黑木耳活性成分的深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
黑木耳粉过100目（黑龙江省科学院微生物研究所），芦丁标准品为分析纯（贵州迪大科技有限责任公司），无水乙醇、异丙醇、正丁醇、福林酚、没食子酸、高氯酸、冰醋酸、香草醛皆为分析纯试剂。
1.2 设备
中草药粉碎机TAISITE（天津市泰斯特仪器有限公司），紫外可见分光光度计UV757CRT（上海仪电分析仪器有限公司），旋转蒸发仪RE-600（北京市永光明医疗仪器厂），电热恒温水浴锅DZKW-D-2、循环水式多用真空泵SHB-B95（郑州长城科工贸有限公司），数控超声波仪KQ300DE（昆山市超声仪器有限公司），数显恒温油浴锅HH-S（江苏金坛市环宇科学仪器厂）。
1.3 试验方法
1.3.1 黑木耳醇提物制备流程及操作要点
1.3.1.1 黑木耳醇提物制备的流程
原料→粉碎→过筛→称取→定量木耳粉→加入醇溶液→超声波处理→回流提取→冷却→抽滤→旋转蒸发→称重→装瓶待用
1.3.1.2 黑木耳醇提物制备的操作要点
（1）超声处理：称量100目黑木耳干粉3.0 g入250 mL锥形瓶；超声功率2000 W，超声处理30 min。
（2）回流提取：将料液转移至圆底烧瓶中，加入小磁块，用恒温油浴锅加热保持料液匀速旋转。
（3）抽滤：先用提取剂润洗抽滤瓶及布式漏斗，放好滤纸，倒入冷却后的料液进行抽滤。
（4）旋转蒸发：将滤液进行旋转蒸发至干，得黑木耳粗提物，称重。每组三个平行。
1.3.2 黑木耳醇提物得率计算方法
黑木耳醇提物得率=（醇提物干重/木耳干重）×100%
1.3.3 乙醇浓度对黑木耳醇提物得率的影响
黑木耳粉3.0 g置锥形瓶中，分别加入60%、70%、80%、90%、100% 乙醇150 mL，超声处理30 min，功率2000 W。将料液回流提取，磁力搅拌器转速600 r/min，提取温度88℃，提取2 h，冷却。将冷却后料液进行抽滤，漏斗中残留物继续用醇溶液润洗3次，每次10 mL。将合并后滤液旋转蒸发至干，蒸发温度50℃，得乙醇提取物。
1.3.4 异丙醇浓度对黑木耳醇提物得率的影响
黑木耳粉3.0 g置锥形瓶中，分别加入60%、70%、80%、90%、100% 异丙醇150 mL，超声处理、回流提取和磁力搅拌同1.3.3，提取温度110℃，提取2 h，冷却、抽滤、残留物润洗同1.3.3，旋转蒸发温度60℃至干，得到异丙醇提取物。
1.3.5 正丁醇浓度对黑木耳醇提物得率的影响
黑木耳粉3.0 g置于锥形瓶中，分别加入60%、70%、80%、90%、100% 正丁醇150 mL，超声处理、回流提取和磁力搅拌同1.3.3，提取温度128℃，提取2 h，冷却、抽滤、残留物润洗同1.3.3，旋转蒸发温度70℃至干，得到正丁醇提取物。
1.3.6 总黄酮含量测定
采用三氯化铝吸光度法测定黑木耳中总黄酮含量，选择芦丁作为标准品，按照文献[8]方法进行芦丁标准曲线制备。
分别将90%乙醇醇提物0.324 g、100%异丙醇醇提物0.305 g、70%正丁醇醇提物0.162 g用适量无水乙醇溶液充分溶解，定容至10 mL。准确量取待检样品1.00 mL，加无水乙醇至10 mL，其他操作同标准曲线。同时做样品空白试验（不加氯化铝显色液，其他操作相同），静置20 min，在415 nm波长处以无水乙醇调节零点，先测样品空白吸光度值，再测样品吸光度值，样品吸光度减去空白吸光度的数值代入标准曲线方程计算得总黄酮含量。
1.3.7 多酚含量测定
采用福林-酚比色法，标准品选用没食子酸，通过标准曲线方程计算多酚含量[14]。
没食子酸标准液浓度0.1 mg/mL。
1.3.7.1 标准曲线的制备
分别移取0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL没食子酸标准液置于25 mL具塞试管中，分别加入福林酚试剂1 mL，摇匀，分别加入12%碳酸钠溶液2 mL，用去离子水定容至25 mL，摇匀。室温下避光反应1 h，于765 nm波长下测定吸光度，用去离子水调节零点，以没食子酸标准溶液的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标制作标准曲线。
1.3.7.2 样品吸光度的测定
分别将90%乙醇醇提物0.324 g、100%异丙醇醇提物0.305 g、70%正丁醇醇提物0.162 g用去离子水充分溶解，并定容至100 mL容量瓶。量取待测样品1 mL加入福林酚试剂1 mL，同上方法测定吸光度，通过标准曲线计算多酚含量。
1.3.8 三萜类化合物含量测定
采用白桦脂醇为标准品，5%香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，通过紫外分光光度法测定三萜类化合物含量。此法已被江西疾病预防控制中心用于灵芝产品的质量评定[13，14]。
（1）白桦脂醇标准溶液制备：精确称取白桦脂醇50 mg，用无水乙醇充分溶解，再用无水乙醇定容至100 mL容量瓶中，制成0.5 mg/mL白桦脂醇溶液待用。
（2）5%香草醛-冰醋酸的制备：精确称取10 g香草醛粉末，用冰醋酸溶解并定容至200 mL容量瓶中。放入冰箱待用。
1.3.8.1 标准曲线的制备
分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的白桦脂醇标准溶液于25 mL具塞试管中，水浴蒸干后分别加入5%香草醛-冰醋酸0.5 mL，然后加入高氯酸0.8 mL，于60℃水浴锅中加热15 min后取出冷却，加冰醋酸定容至25 mL。摇匀，以冰醋酸调节零点，测定吸光度。以白桦脂醇质量为横坐标，以吸光度为纵坐标制作标准曲线。
1.3.8.2 样品吸光度测定
分别将90%乙醇醇提物0.324 g、100%异丙醇醇提物0.305 g、70%正丁醇醇提物0.162 g用冰醋酸充分溶解，并定容至10 mL容量瓶，放入冰箱待用。量取待测样品0.1 mL水浴蒸干后，加0.5 mL 5%香草醛-冰醋酸，加0.8 mL高氯酸，同上方法测定吸光度，通过曲线计算样品总三萜含量。
1.3.9 RRPM中总黄酮、多酚、三萜类化合物含量的测定
黑色素提取方法：80目黑木耳粉加入50倍体积蒸馏水，80℃水浴1.5 h，重复2次，去除多糖等水溶性成分，8000 r/min离心15 min，残渣70℃干燥，粉碎过100目筛，加入30倍体积3 mol/L盐酸溶液，70℃水浴1 h，8000 r/min离心15 min，沉渣加入3 mol/L NaOH溶液调pH为12，70℃水浴浸提1 h，10 750 g离心15 min，上清液酸沉过夜得黑色素，沉渣用蒸馏水洗三次，60℃干燥得到黑木耳提取多糖和黑色素后残渣（Residues Removed Polysaccharides and Melanin，RRPM）。将RRPM用90%乙醇、100%异丙醇和70%正丁醇醇提，总黄酮、多酚、三萜类化合物测定方法同前。
2 结果与分析
2.1 黑木耳醇提物最优浓度确定
2.1.1 乙醇浓度对黑木耳醇提物得率的影响
不同乙醇浓度的黑木耳醇提物得率如图1-a所示，随着乙醇浓度增加，黑木耳醇提物得率呈现先增加后平稳的趋势，当浓度为80%时，醇提物得率为7.5%，浓度为90%时，醇提物得率为10.7%，浓度达到100%时，得率增加不明显，为11.5%，这可能由于乙醇浓度过高使得黑木耳中一些物质，如蛋白质等发生凝固变性，使收率不再增加，因此90%乙醇溶液为最佳。
2.1.2 异丙醇浓度对黑木耳醇提物得率的影响
不同异丙醇浓度的黑木耳醇提物得率如图1-b所示，随异丙醇浓度增加，黑木耳醇提物得率一直保持增长趋势，当异丙醇浓度为100%时，醇提物得率达到10.1%。这可能由于异丙醇浓度越高，黑木耳中能溶于异丙醇的成分越多，因此100%异丙醇溶液为最佳。
2.1.3 正丁醇浓度对黑木耳醇提物得率的影响
不同正丁醇浓度的黑木耳醇提物得率如图1-c所示，随正丁醇浓度增加，黑木耳醇提物得率呈现缓慢增长趋势，当浓度为60%时，醇提物得率为2.7%，浓度为70%时，得率可达5.4%，但当浓度继续增加时，得率增加并不明显，这可能由于正丁醇70%以上浓度对黑木耳中可溶于正丁醇的物质溶出率影响不大。因此70%正丁醇溶液为最佳。
2.2 黑木耳醇提物中总黄酮、多酚、三萜类化合物含量
2.2.1 黑木耳醇提物中总黄酮含量
用芦丁标准溶液建立标准曲线（图2），得线性回归方程，由样品吸光度值计算得样品总黄酮含量。乙醇、异丙醇、正丁醇醇提物中总黄酮含量见表1。
2.2.2 黑木耳醇提物中多酚含量
没食子酸标准曲线如图3所示，由样品吸光度值计算得样品多酚含量。乙醇、异丙醇、正丁醇醇提物中多酚含量见表1。
2.2.3 黑木耳醇提物中三萜含量
三萜含量测定方法得到白桦脂醇标准曲线见图4。乙醇、异丙醇、正丁醇醇提物中总三萜含量测定结果见表1。
2.3 RRPM醇提物中总黄酮、多酚和总三萜测定
图1 乙醇、异丙醇和正丁醇浓度对黑木耳醇提物得率的影响
表1 黑木耳醇提物总黄酮含量
图2 芦丁标准曲线
图3 没食子酸标准曲线
图4 白桦脂醇标准曲线
RRPM乙醇提取获得醇提物得率为13.8%；异丙醇提取获得醇提物得率为14.3%；正丁醇提取获得醇提物得率为8.9%。乙醇、异丙醇醇提物中总黄酮、多酚和总三萜含量如表1所示。
3 小结
在同样提取条件下，90%乙醇和100%异丙醇获得的黑木耳醇提取物收率（10.7%和10.1%）均相当于70%正丁醇（5.4%）的2倍。
最优条件提取的各组黑木耳醇提物中，经分析测定可知：乙醇作为提取剂获得的醇提物中总三萜的含量（0.55%）显著高于异丙醇（0.37%）和正丁醇（0.30%）（P＜0.01）；而正丁醇作为提取剂获得的醇提物中多酚的含量（1.68%）显著高于乙醇（0.43%）和异丙醇（0.66%）P＜0.01。三者醇提物中的总黄酮含量有差异（分别为5.68 mg/100 g、4.84 mg/100 g和4.07 mg/100 g。），其中乙醇提取总黄酮含量最高，与正丁醇提取的总黄酮收率比较差异极显著（P＜0.01）。
RRPM的90%乙醇、100%异丙醇和70%正丁醇醇提物得率与对应黑木耳的醇提物得率相比分别高2.1%、4.2%和3.5%；RRPM的三种醇提物中总黄酮含量均比黑木耳醇提取中大幅增加（分别增加2.6 mg/100 g、7.15 mg/100 g和 8.31 mg/100 g）；而多酚含量均比黑木耳粉醇提物中有所降低；总三萜含量差异呈现不规律状态即RRPM乙醇提取物中的总三萜含量比黑木耳粉醇提物中的总三萜含量大幅降低，而异丙醇和正丁醇提取物中的总三萜含量比黑木耳粉醇提物中的总三萜含量有较大增加，差异显著（P＜0.01）。试验结果为黑木耳活性成分的进一步研究和开发提供参考。
