硒对液体培养黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响初探

周连玉 更尕求卓 唐德华 米 琴

（青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室∕青海师范大学生命科学学院，青海西宁810008）

目前食物向多样化发展，人们已注意膳食的合理搭配以及常量元素与微量元素的摄入比例。在缺乏的必需微量元素中，硒缺乏就在其中之一，硒是人体谷胱甘肽过氧化物酶的活性成分，硒能调节氧化还原反应速度，强化某些酶系统的活性及调节维生素A、C、E、K在体内吸收和消化；还可对汞、镉等重金属具有解毒作用[1]。无机硒在体内不易吸收且毒性强，人体对有机硒的吸收率比无机硒高30%，毒性也小，并且可以在人体组织内储存[2]。而许多生物能使添加的外源无机硒转化为易被体内吸收利用的有机硒。

近年来国内的研究发现，杏鲍菇、灵芝、鸡腿菇、平菇、灰树花等多种食药用菌具有较强的富硒能力，然而不同种蕈菌液体耐硒能力有差别，其菌丝体生长受菌株特性、培养基、硒浓度、加硒时间、培养时间、pH、接种量、摇床转速、装液量等多种因素的影响[3-7]。有许多研究表明：不同菌株在一定硒浓度下富硒后能提高发酵液或菌丝体的营养价值及活性作用[8-11]，还转化硒的形态[4]，因此可作为补硒营养品和应用于高附加值的食品中[12-13]。

黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens）是一种大型真菌，隶属于担子菌亚门，层菌纲，口蘑目，口蘑科，蜜环菌属。在青海主要生长在海拔3000～4300 m的草甸上，大多分布于海北（祁连、海晏、刚察）、黄南（泽库、河南）、海南（共和、贵德、兴海）、果洛（玛沁、甘德、久治）及高海拔的玉树地区；以及四川、西藏、河北、陕西、甘肃等省区也有分布[14]。目前黄绿蜜环菌还属于野生菌，因此无法进行人工栽培。研究多集中于其生物学特征、人工培养、化学成分分析、分子鉴定、生态特性等方面[15-24]。利用黄绿蜜环菌生物转化法生产特定物质的相关报道很少，在一定转化体系中黄绿蜜环菌可生物转化合成天麻素[25-26]，LIU J等[27]发现黄绿蜜环菌ZJUUQH100-6菌株在适宜条件下可以将白桦脂醇转化合成白桦脂酸。试验研究亚硒酸钠对黄绿蜜环菌液体培养菌丝体生物量的影响，旨在为黄绿蜜环菌富硒的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株

黄绿蜜环菌菌株HM，由青海师范大学微生物实验室提供。

1.1.2 培养基

活化菌株采用PDA培养基，配方为马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1000 mL。种子培养基采用PDB，配方为马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL。发酵培养基：蔗糖4%，牛肉膏0.10%，KH2PO40.10%，MgSO40.10%。

1.2 试验方法

1.2.1 液体菌种的制备

250 mL三角瓶中装入种子培养基100 mL，将3块4 mm的菌块接到培养液中，于25℃培养4 d。

1.2.2 不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响

以15%的接种量将液体菌种接到含亚硒酸钠的浓度分别为0 mmol∕L（CK）、0.20 mmol∕L、0.40 mmol∕L、0.60 mmol∕L、0.80 mmol∕L、1.00 mmol∕L 的发酵培养基中。25℃培养8 d，测定富硒黄绿蜜环菌菌丝体生物量。每个浓度设三次重复。

1.2.3 添加硒时间对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响

以15%的接种量将液体菌种接入发酵培养基，以上述试验确定的适宜硒浓度后，将分别在0 d、2 d、4 d、6 d时将亚硒酸钠添加到发酵培养基，重复3次。25℃培养8 d，测定富硒黄绿蜜环菌菌丝体生物量。

1.2.4 硒对黄绿蜜环菌菌丝体动态性的影响

以最适硒浓度、最适添加硒时间进行黄绿蜜环菌深层富硒动态培养。分别以添加亚硒酸钠和不加硒的发酵培养基为富硒处理组与对照组，25℃培养，在发酵时间5 d、6 d、7 d、8 d时，分别对富硒处理组与对照组进行取样，重复三次，测定黄绿蜜环菌菌丝体生物量。

1.3 菌丝体生物量的测定

培养液过滤获得菌丝体和发酵液，并用蒸馏水反复清洗菌丝体至滤液无色，菌丝体于60℃干燥至恒重，电子天平称重测得菌丝体生物量。

1.4 统计分析

试验数据结果均采用平均值±标准误表示，不同硒浓度处理下菌丝体生物量和不同加硒时间下菌丝体生物量差异性比较用SPSS 16.0统计分析软件进行单因素方差分析（LSD，P＜0.05）。加硒组和对照组菌丝体生物量动态性的显著性通过独立样本的t-test进行检测。

2 结果与分析

2.1 不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响

不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌丝生长的影响结果如图1所示。供试黄绿蜜环菌菌丝在5种加硒培养基里均能生长，而硒浓度为0.80 mmol∕L能显著提高黄绿蜜环菌菌丝体生物量（P＜0.05），但其他硒浓度与对照之间不存在显著性差异。

图1 不同硒浓度对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响

2.2 不同加硒时间对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响

由2.1试验结果确定适宜硒浓度为0.80 mmol∕L，探讨不同加硒时间对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的研究，结果如图2所示，与不加硒相比，除第6天时加硒组与不加硒组之间不存在显著性差异，其他时间加硒显著提高黄绿蜜环菌菌丝体生物量（P＜0.05），而第4天加硒菌丝体生物量增长最大，达到9.32%。

图2 不同加硒时间对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响

2.3 硒对黄绿蜜环菌菌丝体生物量累积动态的影响

黄绿蜜环菌菌丝体生物量动态变化如图3所示，富硒组与对照组的菌丝生长动态规律基本一致。于发酵时间5 d、6 d、8 d时加硒组与不加硒两者之间的菌丝体生物量干重不存在显著性差异。与对照组相比，在培养时间第7天时硒显著提高黄绿蜜环菌菌丝体生物量（P＜0.05），且增长幅度达到33.33%。

图3 不同发酵时间硒对黄绿蜜环菌菌丝体生物量的影响

3 小结与讨论

食药用菌富硒菌丝体生物量与硒浓度密切相关，硒浓度不同所起到促进或抑制的作用也各异[6-7]。本试验发现，发酵培养基中添加硒后，黄绿蜜环菌的菌球呈现红色（有些菌球内层红色外层为白色），当硒浓度0.80 mmol∕L时，显著提高菌丝体生物量的含量（P＜0.05，图1），可见，在适宜硒浓度下可促进黄绿蜜环菌菌丝生长。

将浓度为100 μg∕mL亚硒酸钠分别于第1天、第3天、第5天加到灵芝发酵培养基中，结果加硒时间为第1天时，灵芝菌丝体生物量最高且发酵液的颜色正常为浅黄色[28]。发现在黄绿蜜环菌培养第4天时加0.80 mmol∕L亚硒酸钠显著提高菌丝体生物量（P＜0.05，图2）。

张炎灼等[29]通过添加3 μg∕mL亚硒酸钠于秀珍菇液体培养基中研究菌丝体动态变化规律，发现对照组与富硒组生长趋势基本一致，于培养72 h时菌丝体生物量达到最大值，分别为1.81 mg∕mL和1.92 mg∕mL，但两者之间不存在显著性差异。发现黄绿蜜环菌于发酵时间7 d时，富硒组菌丝体生物量显著高于对照组，而在发酵时间5 d、6 d和8 d时富硒组生物量略大于对照组（P＜0.05，图3），这一结果也表明了适当硒浓度能促进黄绿蜜环菌菌丝体生长。

总之，硒对食药用菌菌丝体生物量有明显的影响，有关硒对黄绿蜜环菌营养成分的作用有待于进一步研究。