生物保鲜剂对鲜切鲫鱼抑菌效果初探

熊海燕，陈 钧

（武汉软件工程职业学院，武汉市药物增溶工程技术研究中心，湖北武汉 430205）

水产品是人类优质蛋白质的主要来源之一，富含人体必需的8种氨基酸[1]。但由于水分含量较高、组织柔软，且自身易携带大量细菌，在贮运、加工与销售过程中，往往容易引起变色、变味，甚至腐败变质，大大降低了食用价值。因此，对渔获后的水产品应当及时采取相应的保鲜处理措施，以延长货架期。

水产品的保鲜方法有物理、化学、生物方法等，其中从动植物、微生物中提取或利用现代生物工程技术得到的生物保鲜剂，如溶菌酶、乳菌链球菌素、茶多酚、壳聚糖、蜂胶、植酸、红曲色素、魔芋葡甘聚糖、生姜汁和鱼精蛋白等，一些安全、营养的生物保鲜剂越来越受人们的关注。例如，从食品安全级微生物——乳酸链球菌发酵产物中提取获得的由34个氨基酸组成的多肽化合物——乳酸链球菌素属于天然的蛋白类物质，对于人体很安全，其对细菌具有形成孔道和抑制细胞壁合成的双重作用机制，对细菌芽孢也具有明显的抗菌活性，从而实现了工业化生产、纯化了用于商业的细菌素[2]。纳他霉素具有广谱、高效、安全等特点，主要用于食品表面防腐。魔芋葡甘聚糖是魔芋的主要成分，由葡萄糖和甘露糖按一定比例通过β-1，4糖苷键聚合而成，可抑制微生物的生长，具有良好的水溶性、胶凝性和成膜性，适合作为涂膜保鲜的基质[3]。生姜具有清除自由基、抗炎、抑制超敏反应等药用保健功能，姜汁对细菌具有明显的抑制作用。这些生物保鲜剂可以减少化学合成杀菌剂对人类健康的不良影响，有效防止病原菌的抗药性，被认为是食品添加剂研究领域最有前景的发展方向。

湖北是鱼米之乡，水产丰富，水产品如何保鲜的问题吸引了众多科研工作者的关注，以单一因子或通过栅栏技术对水产品进行防腐保鲜的研究报道不断涌现，其保鲜效果的评判指标主要有感官品质、菌落总数、pH值、水分活度、挥发性盐基氮等。而少见以抑菌圈直径为评判指标进行研究。但在微生物学上，抑菌圈大小是评判药剂抑杀菌效果的重要依据。因此，试验选取乳酸链球菌素、柠檬酸、魔芋葡甘聚糖、生姜汁、海藻酸钠、甘氨酸6种生物保鲜剂对鲫鱼进行保鲜处理，获得各保鲜剂合适的质量浓度，再进行抑菌圈试验，比较抑菌作用效果，以期为鲫鱼保鲜提供安全有效的生物保鲜剂。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

（1） 新鲜活鲫鱼。每尾质量约500 g，去头尾、内脏，清洗，切成3 cm×4 cm的块状，备用。

（2） 试剂。乳酸链球菌素、海藻酸钠、柠檬酸、魔芋葡甘聚糖、甘氨酸，以上试剂均为食品级、生物试剂；生姜，购自学校附近集贸市场。

（3） 供试菌种。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，武汉软件工程职业学院微生物实验室提供。

（4） 培养基。牛肉膏蛋白胨培养基、M-H琼脂培养基（生物试剂）。

（5）保鲜材料。PE保鲜膜，规格30 cm×30 m。

1.1.2 仪器与设备

250B型生化培养箱、DZKW-0-2型恒温水浴锅、KK19V41TI型冰箱、ALC210.4型电子天平、SW-CJ-2F型超净工作台、DHG型电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 试验方法

1.2.1 6种生物保鲜剂最佳质量浓度的筛选

将生姜榨汁，配成生姜原液，按表1配成相应质量浓度的生姜汁；选取乳酸链球菌素、柠檬酸、魔芋葡甘聚糖、海藻酸钠、甘氨酸5种保鲜剂，以无菌水为溶剂，按照表1配制成溶液。将新鲜鱼块分别放入上述保鲜剂共24瓶溶液中，5 min后取出，采用保鲜膜包好后放入培养皿中，置于恒温培养箱中，于37℃条件下培养24 h后取出，捣碎，稀释至1×10-6，分别取1 mL置入无菌平皿中，倾入牛肉膏蛋白胨培养基，混匀，于37℃条件下倒置培养48 h后计数。再根据菌落总数确定各生物保鲜剂的最佳质量浓度。

6种生物保鲜剂最佳质量浓度筛选试验设计见表1。

1.2.2 6种最佳质量浓度生物保鲜剂的抑菌试验

采用筛选出的6种最佳质量浓度生物保鲜剂进行体外抑菌试验。试验流程如下。

表1 6种生物保鲜剂最佳质量浓度筛选试验设计/g·100 mL-1

配制菌悬液→配制保鲜剂→自制保鲜剂滤纸片→进行抑菌试验→测量抑菌圈直径。

（1） 菌悬液的制备。将供试菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌分别接种到斜面牛肉膏蛋白胨培养基上，再培养18～24 h，取出后使用5 mL无菌生理盐水洗出，稀释成质量浓度为1×107～1×108CFU/mL的菌悬液置于无菌操作室内备用。

（2） 配制保鲜剂。以无菌水为溶剂，根据“1.2.1”的试验结果配制各保鲜剂溶液100 mL。

（3）自制保鲜剂滤纸片。将定性滤纸用打孔器制备一定数量的6 mm直径的圆形小纸片，将其放入洁净空瓶中包扎，于0.1 MPa压力下20 min高压灭菌，取出，置37℃烘箱内烘干，在“1.2.2（2）”已配制好的100 mL各保鲜剂中分别放入12片，翻动纸片，使各纸片充分浸透药液后取出，放入37℃温箱内稍许烘干备用。另以无菌水浸过的滤纸片做空白对照。

（4）抑菌试验。①倒平板，将M-H琼脂培养基溶化后倒平板，要求平皿中培养基为4 mm的均匀厚度。使用前将培养基放在37℃培养箱中培育30 min，使其表面干燥。②接种，无菌操作，用无菌吸量管分别吸取培养24 h的供试菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌100 μL菌液到M-H琼脂培养基中，用无菌涂布棒进行涂布。③贴滤纸条，用无菌镊子取自制保鲜剂滤纸片分别贴在平板上。每个平板贴5片（周围4片为同一种保鲜剂同一浓度滤纸片，中间1片为空白），每片间距不少于为24 mm，纸片中心离皿边不少于15 mm，在菌接种后15 min内贴完纸片。④培养、观察，将接种后的平板倒置于37℃恒温箱保温培养24 h后，取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，记录并计算平均值。

2 结果与分析

2.1 6种生物保鲜剂最佳质量浓度的筛选结果

通过平皿计数法，得到6种生物保鲜剂不同质量浓度处理的菌落总数大小顺序如下：

生姜汁 （g/100 mL） 75＞25＞50＞100，乳酸链球菌素 （g/100 mL） 0.15＞0.05＞0.10＞0.20，柠檬酸（g/100 mL）0.40＞0.70＞1.00＞1.30，魔芋葡甘聚糖 （g/100 mL） 0.80＞1.00＞0.60＞0.40，海藻酸钠 （g/100 mL） 0.50＞1.00＞2.00＞1.50，甘氨酸 （g/100 mL） 0.05＞0.10＞0.15＞0.20。

由此确定各保鲜剂最佳质量浓度分别为100g/100mL生姜汁，0.20 g/100 mL乳酸链球菌素，1.30 g/100 mL柠檬酸，0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖，1.50 g/100 mL海藻酸钠，0.20 g/100 mL甘氨酸。

2.2 6种最佳质量浓度生物保鲜剂抑菌效果的比较

6种生物保鲜剂体外抑菌效果（X±s，n=4） 见表2。

表2 6种生物保鲜剂体外抑菌效果（X±s，n=4）/mm

由表2可以看出，对金黄色葡萄球菌，抑菌圈直径由大到小顺序为1.30 g/100 mLL柠檬酸＞100 g/100 mL生姜汁＞0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖＞0.20 g/100 mL乳酸链球菌素=1.50 g/100 mL海藻酸钠；对大肠杆菌，抑菌圈直径大小顺序为1.30 g/100 mL柠檬酸与0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖抑菌效果相当，抑菌圈直径最大，后面依次是100 g/100 mL生姜汁、0.20 g/100 mL乳酸链球菌素、1.50 g/100 mL海藻酸钠；对枯草芽孢杆菌，抑菌圈直径由大到小顺序为1.30 g/100 mL柠檬酸＞100 g/100 mL生姜汁=1.50 g/100 mL海藻酸钠＞0.20 g/100 mL乳酸链 球菌素＞0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖。相比较而言，1.30 g/100 mL柠檬酸抑菌效果最好，0.20 g/100 mL甘氨酸几乎无抑菌效果。

3 结论

从试验结果看，柠檬酸对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）均有较强的抑菌效果，生姜汁、魔芋葡甘聚糖抑菌效果较好，海藻酸钠、乳酸链球菌素的抑菌效果一般，甘氨酸几乎无抑菌效果。

研究选择的菌种均为实验室常规典型菌种，与引起淡水鱼腐败变质的菌种（假单胞菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、摩氏杆菌属等[4]）存在一定差异。在研究保鲜剂的抑菌效果时，不同保鲜剂对不同菌种的抑杀菌效果会有所不同，但研究方法应该是一样的。试验中1.30 g/100 mL柠檬酸抑菌效果最好，作为一种有机酸，不仅改变环境pH值，影响微生物抗热性，还赋予鲜切鲫鱼一定的酸味，是一种理想的水产品保鲜剂，但到底是单一使用的效果好还是与其他生物防腐剂复配效果好还需进一步探讨。